Evaluación de la función motora en un modelo experimental de ratón con neuritis autoinmune

Abstract

Fuente: Gonsalvez, D. G., et al., Un enfoque simple para inducir neuritis autoinmune experimental en ratones C57BL/6 para evaluaciones funcionales y neuropatológicas. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra el proceso de evaluación de la disfunción motora en un modelo de ratón mediante la administración de toxina de tos ferina y un inóculo que contiene péptidos y adyuvantes que imitan la mielina, seguido de pruebas en cinta rodante para evaluar la función motora y evaluar el daño nervioso resultante debido a la activación inmune y la desmielinización.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inducción de EAN (Neuritis Autoinmune Experimental)

NOTA: La EAN se puede inducir con éxito en ratones machos C57BL/6 de entre 6 y 8 semanas de edad. El protocolo de inducción dura 9 días en total. El día 0 se refiere al día de la primera inmunización. Para este protocolo, las inyecciones se realizaron bajo anestesia (ver paso 1.1.2 a continuación).

1. En el día -1:
   1. Prepare la solución de toxina de tos ferina (ver tabla de materiales) de 1,6 μg/mL utilizando solución salina estéril tamponada con fosfato isotónico de ratón 0,1 M (MT-PBS).
   2. Anestesia con isoflurano:
      1. Coloque el ratón (C57BL/6, macho, 6-8 semanas) en la cámara de anestesia y ajuste el flujo de oxígeno a 1 L/min.
      2. Encienda el vaporizador de isoflurano, ajústelo al 2.5% para anestesia, controle la respiración y espere 2 minutos o hasta que los reflejos primarios (córnea y miembro posterior) ya no respondan.
   3. Retire el ratón de la cámara de anestesia y administre 250 μL de la solución de toxina para la tos ferina mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) con una jeringa de 0,5 mL con una aguja de 30_1/2 G.
   4. Preparar el inóculo inyectable para la inmunización:
      1. Prepare la solución A utilizando una solución de 2 mg/ml del péptido P0180-199 (con > 98% de pureza, secuencia S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) en solución salina al 0,9%.
      2. Prepare la solución B utilizando una solución de 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis (ver Tabla de Materiales) en el adyuvante completo de Freund (FCA, compuesto por 15% de monoolato de mannide + 85% de aceite de parafina y 0,5 mg/mL de Mycobacterium butyricum desecado y muerto).
      3. Para hacer el inóculo final para la inyección, combine partes de igual volumen de las soluciones A y B en un batidor de perlas y mézclelas a velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente><. nota: Las soluciones A y B pueden conservarse como reserva y almacenarse a 4 °C durante un máximo de un mes, pero el inóculo final combinado debe estar recién preparado el día de la inyección en ratón.
2. El día 0, administrar 50 μL del inóculo (preparación descrita en el paso 1.1.4) en un ratón mediante una inyección subcutánea con una aguja de 23 G.
   nota: La inyección puede colocarse entre los omóplatos o entre la extremidad posterior y la cola sobre el dorso caudal.
3. El día 1, prepare la solución de toxina para la tos ferina de 1,2 μg/mL (en MT-PBS) y administre 250 μL en un ratón mediante inyección i.p. utilizando una jeringa de 0,5 mL con una aguja de 301/2 G.
4. El día 3, repita el paso 1.3 anterior.
   nota: Las soluciones madre A y B pueden prepararse y almacenarse a 4 °C durante un máximo de un mes. Sin embargo, el inóculo inyectable final, producido mediante la combinación de las soluciones madre A y B, debe realizarse el mismo día de la inyección.
5. El día 8, administrar 50 μl del inóculo (preparación descrita en el paso 1.1.4) en un ratón mediante inyección subcutánea (véase el paso 1.2 anterior) en el mismo lugar de inyección que en el paso 1.2 (para cada animal)

>2. Evaluación de la función motora

>NOTA: El rendimiento motor se evalúa en paralelo con la puntuación clínica para la misma cohorte de animales. El aparato de evaluación de la función motora debe estar conectado a una computadora que tenga instalado un sistema de imágenes de la función de la marcha (ver Tabla de Materiales). También se recomienda que todos los ratones que se van a evaluar estén habituados a la tarea de correr antes de la inducción de la EAN. Para ello, se realizan prácticas (2 pruebas por ratón) tres días antes de la inducción de la enfermedad (día -3).

1. Encienda el aparato de evaluación de la función motora y encienda el botón de luz.
2. Frote el ratón firmemente y entinta sus patas bajándolo sobre un recipiente lleno de tinta roja mientras sostiene su cola.
   nota: Este paso es necesario para la cepa C57BL/6, pero se puede omitir si se utiliza una cepa de ratón con un color de pelaje blanco.
3. Coloque el ratón en el compartimento para caminar y ajuste la velocidad de la cinta de correr a 15 cm/s.
4. Encienda la cinta de correr y haga clic en el botón "grabar" para capturar el movimiento de carrera del mouse utilizando el sistema de imágenes de la función de marcha (consulte la Tabla de materiales).
5. Use un temporizador y mida cada carrera durante 36 s. Después de 36 s, detenga la grabación y detenga la cinta de correr.
   nota: Se considera que los ratones que no pueden completar con éxito la tarea en ejecución durante este intervalo de 36 s han fracasado.
6. Guarde el archivo de video en la carpeta designada.
7. Repita los pasos anteriores para cada mouse que se evalúe. Pruebe los ratones con la misma tarea de ejecución cada 3 días.
8. Analice los archivos de video editados utilizando software para los parámetros de la función de la marcha (ver Tabla de Materiales).
   nota: Los detalles de cómo analizar los diferentes parámetros del motor varían según el software, así que consulte las instrucciones del fabricante antes del análisis. Dependiendo de los objetivos específicos de la investigación, se pueden tomar tejidos animales en cualquier etapa de la evaluación de la función motora posterior para obtener evidencia histológica de daño axonal y mielina mediante inmunohistoquímica o microscopía electrónica.

Results

Tabla 1: Paradigma de puntuación clínica de EAN.

puntuación	criterios	Notas y comentarios sobre los criterios de evaluación
0	Ratón normal
1	Menos vivo O espumoso	Esto se evalúa e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, macho, 6-8 semanas de edad	Centro Australiano de Biorecursos, WA, Australia
Toxina de la tos ferina	Lista Biological Laboratories, Inc., CA, EE. UU.	#181
0,1M de solución salina tamponada con fosfatado isotónico de ratón (MT-PBS)			Los laboratorios tendrán su propio protocolo.
Isoflurano	Pharmachem, QLD, Australia		Los laboratorios tendrán su propio protocolo de administración.
Péptido P0180–199	Wuxi Nordisk Biotech Co. Teniente SHG, CHN		P0180–199, secuencia S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Mycobacterium tuberculosis mató por calor (cepa H37RA)	Difco, Michigan, Estados Unidos	#231141
Adyuvante completo de Freund (FCA)	Difco, Michigan, Estados Unidos	#263910
16% Paraformaldehído (PFA)	Servicios de Microscopía Electrónica	#15710	Diluir al 4% de PFA el día de la recolección de tejidos.
25% Glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Diluir al 2,5% de glutaraldehído el día de la fijación.
Azida de sodio	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Cree un 10% (p/v) de stock en 0,1 millones de MT-PBS. Úselo al 0,03% (v/v).
sacarosa	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Úselo al 30% (p/v).
Temperatura óptima de corte (OCT) media	Sakura Finetek, CA, EE. UU.	#4583
Suero de burro normal	Merck Millipore, MA, EE.UU.	#S30-100	Uso como diluyente de anticuerpos al 10% (v/v) u otra concentración determinada por el propio laboratorio.
Tritón-X 100	Sigma Aldrich, Michigan, Estados Unidos	#90o2-31-1	Uso en diluyente de anticuerpos al 0,3% (v/v) u otra concentración determinada por el propio laboratorio.
Proteína precursora anti-amiloide (APP) de conejo	Invitrogen (Life Technologies), CA, EE. UU.	S12700	Se utiliza a 1:400 o se valora en el propio laboratorio.
Proteína 1 asociada a anti-contactina de conejo (Caspr)	Donación del Prof. Elior Pelés, Instituto Wiezmann de Ciencias, Israel		Se utiliza a 1:500 o se valora en el propio laboratorio.
Anticuerpos secundarios conjugados Alexa Fluor apropiados	Sondas moleculares (Life Technologies), Oregón, EE. UU.	varios	Úselo a 1:200 o valore en su propio laboratorio. La elección de la especie en la que se crió el anticuerpo y la elección de Alexa Fluor queda a discreción de cada laboratorio.
Solución de montaje acuoso	Dako (Agilent), CA, EE. UU.	#S3023	Cada laboratorio tendrá su propia preferencia.
equipo
Jeringa de 0,5 ml con agujas de 301/2 g	Bd	#326105
Agujas de 23 g	Bd	#305143
Almohadilla de tinta roja			Cualquier almohadilla de tinta roja o colorante alimentario rojo podría usarse para marcar las patas de los animales.
Aparato DigiGate (incluye cinta de correr)	Especificaciones de eMouse Inc. Framingham, MA
Sistema de imágenes DigiGate	Especificaciones de eMouse Inc. Framingham, MA
cronómetro			Se puede utilizar cualquier temporizador.
Software DigiGait 8	Especificaciones de eMouse Inc. Framingham, MA
Microscopio de disección	Zeiss		Se puede utilizar cualquier microscopio de disección apropiado.
Portaobjetos cargados	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Se puede utilizar cualquier cirostato adecuado.
Equipos de perfusión e instrumentos de disección			Los laboratorios tendrán sus propios protoctotles de perfusión.
Cámara humificada opaca			Los laboratorios pueden producir los suyos propios utilizando un recipiente de plástico opaco.
Pena PAP	GeneTex (Estados Unidos)		También se puede usar un lápiz de cera o tensión superficial para crear un hueco alrededor de la sección de tejido.
Microscopio confocal	Zeis LSM780		Se puede utilizar cualquier microscopio confocal con líneas láser adecuadas.
FIJI/Imagen J	Institutos Nacionales de Salud		Disponible desde www.fiji.sc