Imagen y cuantificación de agregados de proteínas en cerebros de Drosophila modificados genéticamente

Abstract

Fuente: Donnelly, K. M., et al. Monitoreo de la transmisión de célula a célula de agregados de proteínas similares a priones en Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de agregados de proteínas en cerebros de Drosophila modificados genéticamente. Los cerebros se fijan, se lavan y se tratan con un agente antidecoloración antes de montarlos. Las imágenes se capturan con un microscopio confocal y se cuantifican para observar la transmisión de los agregados de proteínas mutantes.

Protocol

>1. Acoplamiento de la expresión de transgenes Htt mediada por Gal4 y QF en Drosophila

1. Recolectar y/o generar líneas transgénicas de Drosophila melanogaster que contengan "conductores" Gal4 o QF específicos del tejido, así como líneas que contengan transgenes Htt mutantes o de tipo salvaje aguas abajo de Gal4-UAS o QF-QUAS. Asegúrese de que las proteínas que se expresan a partir de estos transgenes se fusionen con proteínas fluorescentes o se marquen con epítopos para permitir la diferenciación de productos transgénicos Htt mutantes y de tipo salvaje en la misma mosca. Ver Figura 1.
   NOTA: Por lo general, usamos fragm....

Results

Figura 1. Un enfoque genético para la expresión acoplada de transgenes Htt mutantes y de tipo salvaje utilizando los sistemas de expresión binaria QF-QUAS y Gal4-UAS. En la "célula A", la proteína Htt mutante marcada con mCherry que contiene un estiramiento polyQ de longitud patógena (Q91) se expresa utilizando un controlador QF ubicado aguas abajo de un promotor A ("PA") específico de tejido. En la .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10X, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Diluir a 1X
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Toallitas Kimwipes	Thomas Científico	2904F24
20% de paraformaldehído (PFA)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15713-S
Suero de cabra normal (NGS), filtrado	Laboratorios Biológicos Lampire	7332500	Alícuota y congelación a la recepción
Pollo anti-GFP	Laboratorios Aves	GFP-1020	Usar en dilución 1:500
Conejo anti-DsRed	Clontech	632496	Úselo con una dilución de 1:2000; puede reconocer proteínas fluorescentes basadas en DsRed (por ejemplo, mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Ratón anti-Bruchpilot	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	nc82	Úselo con una dilución de 1:100; marcará las estructuras presinápticas activas en todo el cerebro de la mosca
FITC anti-pollo	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Usar en dilución 1:250
Alexa Fluor 568 anti-conejo	Tecnologías de la Vida	A11011	Usar en dilución 1:250
Anticuerpo anti-ratón Alexa Fluor 647	Tecnologías de la Vida	A21235	Usar en dilución 1:250
Reactivo antidecoloración de oro Slowfade	Tecnologías de la Vida	S36936
Portaobjetos de microscopio (25 x 75 x 1,0 mm)	Fisher Científico	12-550-143
Cubierta de vidrio (22 x 22 mm)	Globo Científico	1404-15
Pinzas Dumont Biology Grade, Estilo 3	Ted Pella	503	Uso en mano no dominante
Pinzas Dumont Biology Grade, Estilo 5	Ted Pella	505	Uso en la mano dominante
Software de análisis de imágenes LAS X	Leica
Software de análisis de imágenes Imaris	Plano de bits