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>1. Acoplamiento de la expresión de transgenes Htt mediada por Gal4 y QF en Drosophila
- Recolectar y/o generar líneas transgénicas de Drosophila melanogaster que contengan "conductores" Gal4 o QF específicos del tejido, así como líneas que contengan transgenes Htt mutantes o de tipo salvaje aguas abajo de Gal4-UAS o QF-QUAS. Asegúrese de que las proteínas que se expresan a partir de estos transgenes se fusionen con proteínas fluorescentes o se marquen con epítopos para permitir la diferenciación de productos transgénicos Htt mutantes y de tipo salvaje en la misma mosca. Ver Figura 1.
NOTA: Por lo general, usamos fragmentos del exón 1 del gen Htt humano. Sin embargo, se pueden generar moscas transgénicas para que expresen fragmentos de Htt más largos u otros genes si se desea.
- Planifique la estrategia genética de manera que los transgenes Htt mutantes y de tipo salvaje se expresen en poblaciones celulares distintas y no superpuestas.
- Si se produce alguna superposición de expresión, las proteínas Htt mutantes y de tipo salvaje sintetizadas en las mismas células se co-agregarán y evitarán la detección de eventos similares a los priones. Para evitarlo, utilice los represores específicos Gal4 y QF, Gal80 y QS40, respectivamente (Figura 1). La selección de impulsores Gal4 y/o QF controlados por el desarrollo puede ayudar a restringir la expresión de Htt mutante a las células postmitóticas, eliminando la posibilidad de que la división celular pueda contribuir a la propagación de agregados de célula a célula.
- Usando condiciones de cultivo estándar, aparea las moscas para generar una progenie que exprese Htt mutante a través de QF (o Gal4) en una población de células "donantes" y Htt de tipo salvaje a través de Gal4 (o QF) en una población de células "receptoras". Véase la Figura 1 para un esquema que muestra una posible combinación genética.
nota: Los controladores QF y Gal4 que se utilizaron para generar los datos que se muestran en las Figuras 1-4 y en nuestra publicación anterior incluyen el controlador de neuronas receptoras olfativas (ORN) DA1, Or67d-QF, y el controlador panglial, repo-Gal4.
- Genere moscas de control en paralelo que expresen Htt de tipo salvaje en poblaciones de células marcadas con QF y Gal4.
- Recolectar progenie del genotipo deseado y envejecer a los animales según corresponda.
>2. Microdisección y fijación de cerebros adultos de Drosophila
NOTA: Este procedimiento de disección ha sido modificado de una publicación anterior y se puede utilizar para preparar cerebros para obtener imágenes de señales de fluorescencia directa de fusiones de proteínas Htt-fluorescentes.
- Recoja los siguientes materiales y colóquelos en hielo: solución salina tamponada con fosfato que contenga Triton X-100 (PBS/T) al 0,03%; tubos de microcentrífuga que contengan 970 μL de solución fijadora de paraformaldehído (PFA) al 4% preparada añadiendo 200 μL de PFA al 20% a 770 μL PBS/T; un plato de vidrio transparente que contenga pozo; una pipeta de transferencia desechable; dos pinzas de disección (una n.º 3 y otra n.º 5).
- Anestesiar a las moscas adultas con CO2 y transferirlas a un pocillo del plato de vidrio con hielo.
- Con una pipeta de transferencia, agregue una pequeña cantidad (~ 500 μL) de PBS/T frío al pocillo que contiene las moscas y a un pocillo vacío. Evite introducir demasiadas burbujas, ya que pueden interferir con la disección.
- Coloque el plato de vidrio sobre una superficie plana debajo de un microscopio de disección y ajuste el aumento hasta que el cuerpo de la mosca llene el campo de visión y esté enfocado.
- Coloque un par de fuentes de luz de cuello de cisne de modo que la luz ilumine ambos lados del plato de vidrio. Ancla un pañuelo de laboratorio doblado debajo del plato de vidrio para desechar las partes del cuerpo o las cutículas durante la disección.
- Usando las pinzas n.º 3 en la mano no dominante, transfiera una sola mosca al pocillo que contiene PBS/T. Inmovilice la mosca agarrando su abdomen con el lado ventral hacia arriba.
- Manteniendo la mosca completamente sumergida en PBS/T, retire la cabeza de la mosca con las pinzas n.º 5 en la mano dominante. Inserte una punta de estas pinzas debajo de la cutícula en el pequeño espacio adyacente a la probóscide en un lado de la cabeza de la mosca. Asegure el agarre de la cabeza pellizcando las pinzas para agarrar el ojo desde ambos lados.
- Retire la cabeza de la mosca de su cuerpo separando las dos pinzas. Deseche el cuerpo de la mosca en un pañuelo de laboratorio colocado cerca. Mantenga la presión sobre las pinzas de mano dominante para que la cabeza de la mosca no se pierda.
- Coloque una punta de la pinza n.º 3 en la mano no dominante en el mismo espacio pequeño debajo de la cutícula al otro lado de la probóscide. Una vez colocados, pellizque las pinzas para agarrar los ojos en el mismo lugar a ambos lados de la cabeza.
- Una vez que el agarre de la cutícula esté seguro, separe suavemente las pinzas a 180°. Esta acción romperá la cutícula de la cabeza sin dañar el cerebro. Deseche los residuos de cutícula en un pañuelo de laboratorio.
- Aunque es ideal, es posible que la cutícula de la cabeza no se elimine por completo en un solo paso. En este caso, retira la cutícula pieza por pieza hasta que el cerebro quede completamente expuesto. Tenga cuidado de no dañar el cerebro evitando el contacto directo con las pinzas.
- Retire el cerebro disecado del PBS/T, ya sea agarrando una tráquea adherida o aspirando el cerebro en el espacio entre las puntas de las pinzas por acción capilar><.
nota: La extirpación de la tráquea es opcional, ya que tiende a no oscurecer los lóbulos antenales en la superficie anterior del cerebro donde normalmente tomamos imágenes. Sin embargo, si la tráquea interfiere con las imágenes, retírela con cuidado para que el cerebro no se dañe por esta manipulación.
- Transfiera el cerebro de la mosca a uno de los tubos de microcentrífuga que contienen una solución fijadora en hielo. Asegúrese de que el cerebro se desprenda de las pinzas y se sumerja en la solución fijadora.
- Una vez que se hayan diseccionado todos los cerebros, sométalos a una "solución corta" colocando los tubos cerrados en un nutator durante ~ 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
NOTA: Este breve paso de fijación asegura que los cerebros sean más fáciles de manejar en los pasos posteriores y no se adhieran a los lados del tubo de microcentrífuga.
- Retire la mayor parte de la solución fijadora con una pipeta P1000 y deséchela.
- Evite aspirar los cerebros del tubo durante este y cualquier paso de lavado posterior. Ajuste el P1000 a un volumen más bajo (por ejemplo, 650 μL) y retire el sobrenadante en dos pasos. Además, sostenga los tubos de microcentrífuga en línea con una fuente de luz (por ejemplo, luces de techo) mientras aspira para visualizar mejor el cerebro.
- Agregue 1 mL de PBS/T fresco al cerebro. Lavar rápidamente (< 1 min) en la oscuridad, aspirar el sobrenadante de los cerebros y desechar.
- Repita el lavado con PBS/T en la oscuridad a temperatura ambiente de acuerdo con el siguiente horario: 2 lavados rápidos (< 1 min), 1 X 5 min, 3 X 20 min y 1 X 1 h de lavado. Asegure las tapas en los tubos de microcentrífuga y colóquelos en un nutator entre lavados.
- Si se desea tinción con DAPI, reemplace el lavado final de 1 h con 1 incubación de 30 min con 250 ng/mL de DAPI diluido en PBS/T, seguido de 2 lavados rápidos y 1 x 20 min.
- Después del último lavado, retire la mayor parte del sobrenadante del tampón de lavado, teniendo cuidado de no perturbar el cerebro, y agregue 30 μL de reactivo antidecoloración a base de glicerol a la cabeza. Incubar a 4 °C en la oscuridad sin movimiento durante al menos 1 h y hasta 24 h.
>3. Montaje de todo el cerebro
- Coloque un portaobjetos de vidrio debajo de un microscopio de disección y etiquételo con información de identificación.
NOTA: Alternativamente, los cerebros se pueden montar directamente sobre una cubierta de vidrio para acceder a ambos lados del cerebro durante la toma de imágenes. Previamente se ha publicado un protocolo que describe este procedimiento de montaje45.
- Retire los cerebros de cada tubo de microcentrífuga con una punta de pipeta desafilada (preparada con una cuchilla de afeitar para quitar la parte inferior ~ 1 cm de una punta de 1-200 μL) y transfiéralos al centro del portaobjetos. Transfiera la menor cantidad posible de reactivo antidesvanecimiento con el cerebro.
- Use fórceps para colocar el cerebro en la orientación deseada (p. ej., dorsal apuntando hacia la parte superior del portaobjetos y la superficie anterior hacia arriba para obtener imágenes del lóbulo antenal). Al orientar los cerebros, tenga en cuenta la trayectoria de la luz del microscopio que se utilizará para obtener imágenes de ellos.
- Retire el exceso de reactivo antidecoloración del portaobjetos utilizando la esquina puntiaguda de un pañuelo de laboratorio doblado sin alterar el cerebro. Deje reposar el portaobjetos durante ~ 5-10 minutos en la oscuridad para permitir que los cerebros se adhieran al portaobjetos.
- Rodea los cerebros de las moscas con cuatro pequeños pedazos de vidrio roto colocados a cada lado de los cerebros para formar un cuadrado de ~ 19 mm x 19 mm. Coloca un borde de un cubreobjetos No. 1.5 de 22 mm x 22 mm justo afuera de uno de estos pequeños pedazos de vidrio, y baja suavemente el cubreobjetos sobre los sesos para completar el montaje del puente.
- Dispense lentamente un nuevo reactivo antidecoloración para llenar la superficie debajo del cubreobjetos, teniendo cuidado de no alterar el cubreobjetos o los cerebros. Limpie cualquier exceso de antidecoloración con la esquina puntiaguda de un pañuelo de laboratorio doblado sin entrar en contacto directo con el cubreobjetos.
- Agrega una gota de esmalte de uñas transparente de secado rápido a cada una de las cuatro esquinas del cubreobjetos. Deje secar durante ~ 10 min. Luego, selle los cuatro bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas para encerrar completamente los sesos.
- Visualice los cerebros inmediatamente o guárdelos a 4 °C hasta que estén listos.
- Si obtiene imágenes de fluorescencia intrínseca a partir de fusiones de proteínas fluorescentes Htt, obtenga imágenes del cerebro dentro de las 24 horas para obtener la mejor señal.
>4. Obtención de imágenes y cuantificación de la transmisión de agregados de tipo prión
- Tome imágenes de los cerebros montados utilizando un microscopio confocal equipado con un objetivo de aceite 40X o 60/63X para recopilar imágenes de corte z a través de la región del cerebro donde se expresan los controladores Gal4 y QF seleccionados (Figura 2A, B).
- Excite las fusiones de proteínas fluorescentes o las proteínas inmunomarcadas utilizando los láseres apropiados (por ejemplo, 488 nm para GFP/YFP/FITC o 552 nm para mCherry/Cy3). Establezca ventanas de detección que capturen una señal fluorescente máxima mientras eliminan la diafonía de canales utilizando un sistema de detección espectral o filtros de emisión de banda/paso largo específicos para cada fluoróforo.
NOTA: Esté atento cuando tome imágenes de agregados de proteínas. Es fácil que los píxeles en el centro de cada agregado se saturen, especialmente en agregados más grandes. Intente minimizar la saturación en la imagen, pero tenga en cuenta el riesgo de perder la señal de las especies agregadas más pequeñas (Figura 2B, C, D). Demasiada saturación aumentará el fondo de la imagen, lo que dificultará la identificación de puntos aislados. Pruebe diferentes configuraciones de imagen para optimizar antes de tomar las imágenes finales en cada conjunto de datos.
- Analice los datos cuantificando los puntos individuales, ya sea manualmente moviéndose a través de cortes z individuales (por ejemplo, Figura 2C y Figura 4A) o después de representar los cortes confocales en 3 dimensiones (Figura 3A, B).
nota: Esto se puede hacer en Image J u otro software de procesamiento de imágenes.
- Si los agregados están bien separados y hay una fluorescencia de fondo mínima, utilice un software de análisis de imágenes para identificar, cuantificar y analizar sistemáticamente los agregados como "objetos" o "superficies" distintos en una reconstrucción 3D de la pila confocal (Figura 3B).
nota: Las acciones de software descritas son específicas del instrumento y software utilizado aquí (consulte la Tabla de materiales).
- Visualice una serie z confocal en modo de visualización 3D. Utilice el asistente "Análisis" para identificar puntos individuales en un canal seleccionado (por ejemplo, el canal rojo para los agregados HttQ91-mCherry en la Figura 3). Ajuste los umbrales y los filtros para representar con precisión todos los agregados de tamaño heterogéneo como objetos individuales en la imagen.
- Habilite "Dividir objetos" en "Prefiltro de procesamiento binario" para separar agregados estrechamente asociados que se fusionan de manera aberrante por el algoritmo del software. Tenga en cuenta que el número total de objetos y sus medidas asociadas se informa en "Mediciones".
nota: Este método para cuantificar los agregados de Htt mutantes no es susceptible del protocolo de inmunotinción porque el centro de los agregados de amiloide es impenetrable a los anticuerpos. Como resultado, los agregados aparecen en el microscopio como estructuras en forma de anillo y el software de análisis de imágenes no puede identificar y distinguir estos "puntos" individuales con precisión.
- Cuantifique los agregados de Htt de tipo salvaje moviéndose manualmente a través de la pila z y marcando los agregados de Htt de tipo salvaje, asegurándose de que no se marque dos veces si aparecen en más de un segmento (Figura 4A).
nota: Este enfoque de cuantificación manual se puede utilizar cuando el número de agregados en cada pila confocal es razonable (por ejemplo, 20-50). También es útil cuando el software de análisis de imágenes no puede distinguir los puntos individuales de la señal circundante en el mismo canal (por ejemplo, la señal de Htt difuso de tipo salvaje en celdas cercanas) (Figura 2B, C y Figura 4A). La cuantificación de los agregados de Htt de tipo salvaje también puede ser un desafío porque muchas estructuras normales en el cerebro parecen punteadas (por ejemplo, procesos celulares y sinapsis). La colocalización de señales Htt de tipo salvaje y mutantes puede utilizarse como criterio de selección; sin embargo, es posible que algunas "semillas" mutantes de Htt caigan por debajo del límite de detección del confocal. Una proteína distinta de la Htt que no se agrega en las células receptoras (por ejemplo, GFP) se puede utilizar para marcar estructuras punteadas no relacionadas en el cerebro.
- Utilice software de análisis de imágenes para realizar una caracterización adicional de agregados individuales. Por ejemplo, determine la distribución del tamaño de los agregados (Figura 3C), el porcentaje de colocalización entre las proteínas Htt mutantes y de tipo salvaje (Figura 4A) o mida directamente las interacciones proteína-proteína utilizando FRET (Figura 4B).
- Determine la distribución de tamaño de los puntos individuales utilizando un algoritmo de detección de puntos o superficies que identifica con precisión todos los agregados visibles en un canal en particular. Utilice el software de análisis de imágenes para tomar medidas relevantes de las manchas o superficies, por ejemplo, obtenga información de 'diámetro agregado' (Fig. 3C), 'volumen' o 'intensidad' de 'Mediciones' en el asistente de software "Análisis" descrito en el paso 4.2.1.
nota: En la Figura 3C, reportamos la distribución de diámetros para todos los puntos HttQ91-mCherry identificados en un solo glomérulo DA1.
- Determine el porcentaje de colocalización entre los agregados HttQ25-YFP y HttQ91-mCherry moviendo manualmente rebanada por rebanada a través de una pila z confocal (el método más preciso). Sin embargo, tenga cuidado de no contar los agregados dos veces. Para evitar esto, solo cuente los agregados en un segmento z particular si el plano de enfoque pasa por el centro del agregado (Figura 4A).
- Calcule la eficiencia FRET para agregados HttQ25-YFP inducidos con señal HttQ91-mCherry colocalizada utilizando el método de fotoblanqueo aceptor.
- En primer lugar, elimine la posible diafonía entre los canales YFP y mCherry estableciendo ventanas de detección para señales solo de mCherry y solo YFP que no producen señal en el otro canal. Con estos ajustes, tome una "imagen de antes" de los puntos HttQ25-YFP individuales y su señal HttQ91-mCherry asociada (Figura 4B).
- A continuación, fotoblanquea la señal mCherry ajustando el láser rojo (por ejemplo, 552 nm) a una intensidad del 100% y escanea hasta que la señal desaparezca. Vuelva a la configuración utilizada para la "imagen de antes" y tome una "imagen de después" de los mismos puntos (Figura 4B).
- Calcule las mediciones de intensidad de fluorescencia para cada punctum antes y después del fotoblanqueo utilizando software de análisis de imágenes.
- Calcule la eficiencia de FRET restando la fluorescencia del donante de YFP medida en la "imagen de antes" (YFPinicial) de la fluorescencia del donante de YFP en la "imagen de después" (YFPfinal). Divida este valor por YFPfinal y multiplíquelo por 100.
nota: La eficiencia FRET se puede calcular píxel por píxel o en general para cada agregado HttQ25-YFP (Figura 4B). El fotoblanqueo aceptor es una técnica particularmente útil para calcular la eficiencia de FRET cuando la señal de mCherry asociada con cada punctum HttQ25-YFP es lo suficientemente alta como para producir un apagado de YFP detectable después del fotoblanqueo de mCherry.
