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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparando al ratón para la cirugía
- Retire el ratón de la jaula de la casa y pese (g).
- Coloque el ratón en una cámara de inducción de isoflurano y ajuste el oxígeno a 2 L/min y el vaporizador de isoflurano a 5 para inducir un plano quirúrgico de anestesia, unos 3-5 min. Controle la respiración lenta y la inmovilización. Compruebe que el ratón esté completamente sedado con el reflejo de pellizco de la punta del pie.
- Cuando el ratón esté completamente sedado, colóquelo en un marco estereotáxico y asegure la nariz en el cono de la nariz, que está unido con un tubo al isoflurano. Inserte las barras de los oídos en el canal auditivo y apriételo, asegurándose de que la cabeza esté estable.
- Afeita la cabeza de oreja a oreja y de entre los ojos hasta detrás de las orejas.
- Esterilice la piel con toallitas alternas de alcohol isopropílico y solución de yodo betadín, 3 veces cada una.
- Aplique lágrimas artificiales en ambos ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento quirúrgico.
>2. Procedimiento quirúrgico
- Controle la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie o la cola. El ratón se encuentra en el plano quirúrgico adecuado cuando no hay respuesta y la respiración es lenta y uniforme.
- Haga una incisión parasagital en la piel desde justo detrás de los ojos hasta casi entre las orejas con un solo movimiento firme con una hoja de bisturí No. 11. Retire la piel y corte el lado derecho con el hemostático.
- Limpie el cráneo de la membrana suprayacente con el lado opaco del bisturí No. 11 y los aplicadores con punta de algodón. Opcionalmente, limpie el cráneo con un aplicador con punta de algodón humedecido en solución salina al 0,9%. Deje que se seque por completo.
- Con una regla pequeña, marque el borde anterior de la craneotomía a 1 mm caudal de la sutura coronal y el borde izquierdo de la craneotomía a 1 mm lateral a la sutura sagital (Figura 1) con un marcador permanente. A continuación, marque los bordes derecho y caudal de la craneotomía a 4 mm de las suturas sagital y coronal, respectivamente (Figura 1).
- Con una broca de 0,5 mm, comience a hacer una craneotomía perforando lentamente siguiendo el contorno del marcador permanente. Asegúrese de no romper el cráneo por completo. Presione suavemente sobre la pieza aislada del hueso parietal con pinzas n.º 5, las áreas de debilidad darán paso a la presión. Cuando el hueso adelgazado es lo suficientemente débil en todo el perímetro, la pieza de hueso está lista para ser extracción.
nota: Si el investigador experimenta dificultad para extraer el hueso de una pieza, esto sugiere que el hueso no se adelgazó lo suficiente durante la perforación. Considere perforar el cráneo más en los animales posteriores para facilitar la extracción fácil de la pieza de hueso.
- Con una jeringa de 10 ml provista de una aguja de 23 G, aplique una pequeña cantidad de solución salina al 0,9% para empapar el hueso aislado y el área perforada.
- Conecte el brazo manipulador al equipo estereotáxico. Coloque una nueva hoja de bisturí n.º 11 en el soporte de la sonda con el lado afilado de la hoja orientado hacia el rostrado.
nota: Aunque los tejidos rostral y caudal experimentan los bordes afilados y romos de la hoja, respectivamente, el daño mecánico inducido por la lesión penetrante es comparable en toda la extensión de la lesión. No observamos diferencias apreciables en las principales características de la gliosis reactiva, incluida la regulación positiva de la expresión o proliferación de GFAP, entre las secciones rostral y caudal.
- Manteniendo el brazo manipulador fuera del camino, levante con cuidado el hueso aislado con pinzas en ángulo de 5/45. Inserte la punta de las pinzas en el costado del hueso aislado y levántelo, usando palanca para sacar el trozo de hueso que quedó en un movimiento completo><.
nota: Tenga cuidado de no apuñalar el cerebro ni perturbar la duramadre debajo del cráneo.
- Tome un pequeño trozo de la espuma de gel absorbible empapada y colóquela sobre el cerebro descubierto para evitar que se seque y absorba la sangre que pueda estar presente.
- Una vez que la espuma de gel esté en su lugar, gire el brazo del manipulador en su lugar y ajuste la cuchilla al centro de la craneotomía sobre la espuma de gel. Retire la espuma de gel y baje la cuchilla hasta que la punta toque la duramadre sin perforarla. Marque las coordenadas dorsal/ventral utilizando la escala vernier en el brazo vertical del estereotáxico.
- Con el brazo del manipulador, baje lentamente la hoja exactamente 3 mm en el cerebro. Esto se logra mediante el uso de las marcas de escala vernier en el brazo del manipulador. Deje que la cuchilla permanezca en su lugar durante 5-10 segundos. Mueva el brazo estereotáxico con la fijación de la cuchilla rostral a la caudal tres veces, permitiendo que la cuchilla alcance los límites rostral y caudal de la craneotomía antes de pasar al extremo opuesto.
nota: La duramadre no se retira antes de insertar la cuchilla. A diferencia de la duramadre de rata, que tiene un grosor de ~80 μm7, la duramadre de ratón es considerablemente más delgada (solo unas pocas capas de células de grosor) y no produce una resistencia apreciable a la hoja del bisturí durante la inserción. Use una nueva hoja de bisturí para cada ratón para asegurarse de que cada animal reciba una lesión consistente.
- Levante lentamente el brazo estereotáxico, retirando la cuchilla del cerebro. Después de retirar la cuchilla, coloque inmediatamente otro trozo de espuma de gel en la superficie del cerebro para absorber el exceso de sangre o líquido.
- Mientras tanto, retire el brazo estereotáxico y deseche la hoja de bisturí No. 11. Una vez que el sangrado se haya detenido, retire la espuma de gel.
- Cierre la herida suturando la piel con suturas no absorbibles, como el etilones o el prolene. Las suturas deben retirarse 9-10 días después de la cirugía.
- Regrese el ratón a su jaula de origen y permita que el ratón se recupere lentamente en una almohadilla térmica y vigile cualquier signo de angustia. La recuperación de la anestesia inducida por isofluorano generalmente ocurre dentro de los 2 a 5 minutos posteriores a la extracción del isofluorano. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la decúbito esternal.
- Administrar 0,5-1 ml de solución de Ringer lactato por vía subcutánea para asegurar la hidratación.
