Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
>1. Sustracción de órganos y determinación de las cargas bacterianas
- Después de la perfusión, extraiga órganos (p. ej., hígado, bazo) retirando cuidadosamente cualquier vasculatura y ligamento adheridos y colocando los órganos por separado en un tubo cónico estéril de 15 mL que contenga 5 mL de PBS estéril frío (4 °C). Almacene las muestras en hielo hasta que se produzca un procesamiento posterior.
- Para extraer el cerebro, decapita la cabeza detrás de las orejas con unas tijeras y corta la piel del cuero cabelludo entre los ojos del animal por la línea media. Si es necesario, recorte el exceso de tejido, manteniendo las tijeras presionadas contra el cráneo.
- Inserte suavemente una punta de las tijeras en el foramen magnum (el orificio en la base del cráneo a través del cual pasa la médula espinal) y corte lateralmente en el cráneo en ambos lados.
- Corta suavemente el cráneo entre los ojos del roedor por la línea media, aplicando presión lateral. Evite perturbar el cerebro y mantenga un contacto mínimo entre el tejido cerebral y las tijeras.
- Con pinzas de punta fina, abra el cráneo para exponer el cerebro y coloque una espátula entre la parte inferior del cerebro y la base del cráneo para extraer el cerebro><.
nota: Esto da como resultado el desgarro de las fibras nerviosas del cerebro.
- Transfiera cuidadosamente el cerebro a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de PBS frío estéril.
- Deseche el cadáver del ratón y repita estos pasos para los animales restantes.
nota: Una vez que se hayan extraído todos los órganos, limpie el área del procedimiento y prepárese para la homogeneización de órganos para determinar las cargas bacterianas.
- Limpie y esterilice la punta de un homogeneizador de tejidos colocado en una cabina de bioseguridad insertando la punta y haciendo funcionar el homogeneizador durante 10 s secuencialmente en lejía al 5 %, agua estéril, etanol al 75 % y agua estéril, cada uno contenido en un tubo cónico separado de 15 mL.
- Homogeneizar el cerebro infectado (~20 s en el ajuste 6, rpm máximas) en el tubo cónico de 15 mL hasta que no queden fragmentos de tejido visibles.
- Limpie el homogeneizador como se describe en el paso 1.3 para evitar la contaminación bacteriana que se transfiere a la siguiente muestra de órgano.
- Realizar el proceso de homogeneización de todos los demás órganos (por ejemplo, hígado, bazo).
- Una vez completado el proceso de homogeneización, limpie el homogeneizador como se describe en el paso 1.3 y guárdelo hasta su uso posterior.
- Prepare diluciones seriadas 10 veces de los homogeneizados de órganos en PBS estériles y coloque las diluciones en placas de agar BHI/estreptomicina para determinar la UFC por órgano.
NOTA: Se realiza un método similar para determinar las UFC por mL de sangre.
- Después de colocar todas las diluciones, transfiera las placas a una incubadora a 37 °C durante la noche.
- Al día siguiente, cuente el número de colonias en cada plato para determinar el número total de bacterias por órgano o ml de sangre de la siguiente manera:
UFC/órgano = (número de colonias x factor de dilución) / mL de homogeneizado chapado x 5
UFC/mL de sangre = (número de colonias x factor de dilución) / mL de sangre sanguínea