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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Protocolo de inmunofluorescencia
- Disección de tejidos
- Sacrificar el pez cebra sumergiéndolo en agua helada (5 partes de hielo/1 parte de agua, 4 °C); dejarlos hasta el cese de todo movimiento para asegurar la muerte por hipoxia.
- Retire la cabeza con una cuchilla de afeitar. Extirpar el tejido blando del lado ventral del cráneo con fórceps. Abra el cráneo y extraiga el hueso del lado ventral del cerebro. Retire la piel y los huesos del cráneo de la cara dorsal del cerebro. Extirpa el cerebro.
- Fijación de tejidos
- Fijar el cerebro por inmersión durante 3 h en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C.
- Preparar tampón de fosfato (PB) 0,1 M disolviendo 1,755 g de NaH2PO4H2O y 4,575 g de Na2HPO4 en 450 mL de agua destilada (dH2O) y ajustar a un pH de 7,4 con la cantidad necesaria de NaOH 1N.
- Preparar PFA al 4% disolviendo 4 g de PFA en 100 mL de PB 0,1 M (pH 7,4) mediante agitación en una placa térmica. Cuando se alcance una temperatura de 60 °C, agregue 2-4 gotas de NaOH 1N para obtener una solución clara. Dejar PFA al 4% a temperatura ambiente (RT) y controlar el pH. Ajuste el pH a 7.4.
nota: El tiempo de fijación depende del tamaño del tejido. La fijación del tejido durante más de 4-6 h puede conducir a una sobrefijación, que enmascara los antígenos y limita la unión anticuerpo-epítopo.
- Inclusión de tejidos
- Enjuague los pañuelos 3 veces durante 5 min cada uno, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Para la crioprotección, transfiera los tejidos a 20% de sacarosa en PB (0,1 M, pH 7,4) y manténgalos toda la noche a 4 °C. A continuación, transfiera los tejidos a sacarosa al 30% en 0,1 M PB (pH 7,4) y manténgalos durante una noche adicional a 4 °C.
- Incruste los tejidos en un bloque de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Para hacer esto, prepare un pequeño dewar de nitrógeno líquido, tome papel de aluminio y córtelo por la mitad para crear una sartén. La bandeja que contiene los tejidos llenos del compuesto OCT debe sumergirse en el nitrógeno líquido hasta que el compuesto OCT se enfríe. Los tejidos congelados se pueden almacenar a -80 °C hasta el corte.
- Corte de tejidos
- Transfiera los bloques de tejido congelado a un criostato a -20 °C y corte en secciones coronales o sagitales de 10 μm.
- Recoja los tejidos en secciones seriadas alternas en portaobjetos de vidrio adhesivo adecuados para inmunohistoquímica y guárdelos a -20 °C hasta su uso.
nota: Guarde las diapositivas entre -20 °C y 4 °C en una caja de diapositivas oscura o en un libro de diapositivas.
- Bloqueo de sitios de unión inespecíficos y permeabilización tisular
- Demarque el área de tejido en el portaobjetos con un bolígrafo resistente a solventes.
- Enjuague las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubar las secciones con suero de burro normal al 1% disuelto en el tampón de permeabilización PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) durante 30 min en RT para permeabilizar la membrana celular y bloquear los sitios de unión inespecíficos.
- Prepare Triton X-100 al 0,3% disolviendo 0,3 mL de Triton X-100 en 100 mL de 0,1 M PB (pH 7,4).
- Prepare la solución bloqueante disolviendo el suero de burro normal al 1% en PB que contenga TritonX-100.
nota: Las especies animales del suero utilizadas en los tampones de permeabilización y bloqueo dependen del huésped del anticuerpo secundario.
- Incubación con mezcla de anticuerpos primarios
- Enjuague las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubar las secciones durante la noche en una caja húmeda a RT con una mezcla de anticuerpos primarios diluidos en PB-T. Se pueden utilizar las siguientes mezclas de anticuerpos primarios: anticuerpo de cabra contra el receptor de orexina (OX-2R) diluido 1:100/anticuerpo de conejo contra el receptor cannabinoide (CB1R) diluido 1:100, o anticuerpo de cabra contra el péptido de orexina (OX-A) diluido 1:100/anticuerpo de conejo contra CB1R diluido 1:100.
- Incubación con mezcla de anticuerpos secundarios
- Enjuague las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubar las secciones durante 2 h en RT con 1) una mezcla de anticuerpo secundario conjugado anti-conejo Alexa Fluor 488 y anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 594 anti-cabra burro diluido 1:100 en PB-T; o 2) una mezcla de anticuerpo secundario conjugado anti-cabra de burro Alexa Fluor 488 y anti-conejo de burro Alexa Fluor 594 anti-conejo anti-anti-conejo diluido 1:100 en PB-T.
nota: Utilizar anticuerpos secundarios desarrollados en el mismo huésped animal. El suero normal debe pertenecer a la misma especie de anticuerpo secundario (p. ej., usar anticuerpos secundarios desarrollados en burro y un suero normal de burro). Diluya los anticuerpos primarios y secundarios con el tampón bloqueante que contiene el detergente para aumentar la permeabilización celular y reducir el fondo.
- Montaje de tejidos
- Enjuague las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Contratinción de las secciones con colorante nuclear DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) preparado disolviendo 1,5 μL de DAPI (1 mg/mL) en 3 mL de PB.
- Portaobjetos con medio de montaje (ver Tabla de Materiales). Este medio de montaje acuoso estabiliza la muestra de tejido y las tinciones para su uso a largo plazo. Las muestras fluorescentes pueden almacenarse en la oscuridad a 4 °C. Para prolongar la vida útil de los fluoróforos, utilice un medio de montaje antidecoloración.
nota: Elija un buen medio de montaje. Uno de los parámetros más importantes de los agentes de montaje es el índice de refracción (nD), que debe ser de alrededor de 1,5, el índice de refracción del vidrio. El medio de montaje utilizado aquí se puede utilizar especialmente con muestras preparadas para determinaciones de enzimas y lípidos (es decir, muestras que no deben deshidratarse con una serie ascendente de alcohol).
- mandos
- Repita las secciones 1.1 a 1.8, omitiendo el anticuerpo primario o secundario, o sustituyendo en el paso específico los antisueros primarios o secundarios por PB (control negativo).
- Repita las secciones 1.1 a 1.8, preabsorbiendo cada anticuerpo primario con un exceso del péptido relativo (100 mg de péptido/1 ml de antisuero diluido).
- Repita las secciones 1.1 a 1.8 en trozos de cerebro de ratón (control positivo).
nota: Prepare todos los tampones frescos, poco antes de comenzar. Retire el exceso de líquido con cuidado en cada paso con una pipeta o papel de filtro alrededor de las secciones, manteniendo siempre la sección húmeda.