1. Estableciendo el modelo BBB
Nota: Para establecer el modelo de barrera hematoencefálica (BBB) sugerimos utilizar células endoteliales microvasculares primarias de cerebro de rata (RBMECs) y astrocitos corticales de rata (RCAs) disponibles comercialmente. Todos los pasos deben realizarse con reactivos estériles y desechables manipulados en una campana de flujo laminar.
- cultivo celular
- Cubra los matraces de cultivo celular con poli-L-lisina 100 μg/ml (1 hora a temperatura ambiente, RT) o fibronectina 50 μg/ml (1 hora a 37 °C) para promover la unión de RCA o RBMEC, respectivamente. A continuación, descongele 1 x 106 RCA y 5 x 105 RBMEC en medio de células endoteliales, suplementado con suero fetal bovino al 5 %, suplemento de crecimiento de células endoteliales al 1 % y penicilina/estreptomicina (sECM) al 1 %. RCAs de semillas en un matraz T175 en sECM de 20 ml y RBMECs en un matraz T75 en sECM.
Nota: Los pasajes de descongelación y siembra de RCA y RBMEC deben ajustarse en términos de densidad celular y tiempo en cultivo de acuerdo con el número de condiciones experimentales que se van a probar con el modelo BBB. Comenzando con 1 vial de 1 x 106 RCA y 1 vial de 5 x 105 RBMEC, es posible obtener hasta 20 insertos con rodamientos BBB.
- Mantenga las células a 37 °C y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada durante aproximadamente 6 días hasta que haya aproximadamente un 80% de confluencia para los RCA y más del 90% para los RBMEC. Separar las células con una solución de ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (tripsina-EDTA) (tripsina 1:250) durante 5 min (1 ml de tripsina para los matraces T75 y 2 ml para los matraces T175). Detenga la actividad de la tripsina con sECM (2:1), centrifugue las suspensiones de la celda a 750 × g durante 5 minutos y vuelva a suspender los gránulos en sECM de 60 ml.
- Divida los RBMEC en 3 matraces T175 y cultive en sECM durante otros 3 días antes de sembrarlos en los insertos. Cuente el número total de RCA vivos observando una suspensión celular diluida 1:1 con azul de tripano bajo un microscopio óptico en una cámara Burker.
- Siembra de células en insertos
- Tratar un lado de la membrana de tereftalato de polietileno (PET) de 6 insertos transparentes de pocillos múltiples con poli-L-lisina 100 μg/mL y el otro lado con fibronectina 50 μg/mL, para permitir la fijación de RCA y BMEC. Manipule los insertos con pinzas para evitar el contacto con la membrana de PET.
- Coloque los insertos en una placa de 6 pocillos y agregue la solución de fibronectina (mínimo 500 μl) en la cámara superior. Después de 1 hora de incubación a 37 °C, retire la solución de fibronectina, retire los insertos de la placa de pocillos múltiples y colóquelos boca abajo en el fondo de una placa de Petri de150 cm 2, que se utiliza aquí como soporte estéril para los insertos ya recubiertos.
- Agregue suavemente 800 μl de poli-L-lisina en la parte inferior del inserto (como se muestra en la Figura 1A; lo que se conoce como siembra de RCA) y mantenga la solución en los insertos durante 1 hora en RT.
- Aspirar la solución y dejar secar los insertos a RT durante 15-30 min. Los insertos ya están listos para la siembra de células, pero también pueden almacenarse en la placa de pocillos múltiples durante varios días a 4 °C antes de proceder a la construcción de BBB.
Nota: Recuerde mantener al menos 3 insertos recubiertos libres de celdas para utilizarlos como controles para validar el establecimiento de BBB mediante mediciones de flujo FD40.
- Siembre RCAs (35.000/cm2) en la parte inferior de los insertos recubiertos de poli-L-lisina dejando caer 800 μl de suspensión celular sobre el inserto invertido (Figura 1A). Deje la suspensión RCA en los insertos durante 4 horas en RT para permitir una unión eficiente de las células a la membrana.
- Aspirar la solución residual, colocar los insertos en pocillos que contengan 2 ml de sECM y mantener la placa multipocillo a 37 °C y 5% deCO2 en una atmósfera humidificada, cambiando el sECM cada 2 días.
- Después de 3 días, cuando los RCA hayan recubierto la cara inferior del inserto, siembre los RBMEC en la parte superior del inserto, siguiendo estos pasos:
- Separe los RBMEC de los matraces T175 y cuente el total de células vivas, como se indica en los pasos 1.1.2 y 1.1.3.
- Siembre RBMECs (60.000/cm2) en la superficie superior del inserto en sECM (1.000 μl) (Figura 1B), dejando 3 insertos con los astrocitos solamente, para ser utilizados como fondo de Resistencia Eléctrica Transendotelial (TEER). Coloque la placa de pocillos múltiples en condiciones de cultivo estándar. Mantenga el sistema en cultivo durante al menos 3 días, cambiando el sECM en la cámara interna e inferior cada 2 días.
>2. Validación BBB
- Medición de TEER
- En el3er día de cocultivo, verifique el TEER insertando los insertos de los cojinetes BBB en una cámara apropiada (con una tapa y donde tanto la cámara como la tapa contienen un par de electrodos de detección de voltaje y corriente), llena con 4 ml de sECM. Conéctelo a un voltímetro/ohmímetro de tejido epitelial.
- Junto con las mediciones de TEER de los sistemas BBB de celda, registre los valores de TEER de las 3 plaquitas que llevan los RCA que se restarán de los valores obtenidos con las BBB. Multiplique los valores de TEER resultantes por la superficie de la plaquita (4,2 cm2) para expresar los resultados como Ω x cm2.
- A partir del3º día de co-cultivo, medir el TEER todos los días. nota: Después de un período inicial en el que el TEER aumenta, los valores registrados deben permanecer estables durante al menos dos días consecutivos (generalmente entre el5º y el7º día de cocultivo). En ese momento, la BBB está lista para el segundo paso de validación (sección 2.2) y/o para los experimentos trans-BBB.
Nota: El procedimiento descrito en la sección 2.1 puede realizarse en los mismos sistemas BBB dedicados a los siguientes experimentos de permeabilidad (sección 3). Operar en condiciones estériles.
>3. Permeación trans-BBB de ferritinas cargadas con FITC (FnN)
>Nota: Una variante recombinante de la ferritina humana (Fn), producida en Escherichia coli y ensamblada en nanojaulas (FnN). Los FnN se cargan con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y las concentraciones tanto de Fn como de las moléculas cargadas se determinan con precisión.
- Flujo trans-BBB de FITC y FITC-FnN
- Mida el flujo de FITC-FnN desde la cámara superior a la inferior de los modelos BBB validados (generalmente entre el5º y el7º día de cocultivo), en comparación con el del colorante libre después de 7 y 24 horas de incubación, de acuerdo con los siguientes pasos:
- Añadir FITC-FnN (50 μg/ml de FnN, 1,1 μM FITC) o una cantidad igual de FITC libre en la cámara superior de al menos 6 sistemas BBB para cada formulación, con el fin de extraer 2 ml de solución de sECM de la cámara inferior de al menos 3 insertos después de 7 horas, y de la cámara inferior de otros 3 insertos después de 24 horas.
- Mida la intensidad de fluorescencia de 500 μl de las muestras recogidas mediante espectrofluorómetro (λex 488 nm, λem 515 nm, rendija 5).
- Obtenga la fluorescencia de fondo de sECM midiendo 500 μl de medio utilizando los mismos parámetros analíticos. Reste la fluorescencia de fondo de sECM de todos los valores de fluorescencia FITC o FITC-FnN.
- Determine la concentración de FITC o FITC-FnN permeado comparando los valores de fluorescencia obtenidos con dos curvas de calibración diferentes producidas con concentraciones conocidas (es decir, 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) del colorante libre o nanoformulado disuelto en 500 μl de sECM.
