Medición de la actividad del proteasoma en diferentes compartimentos subcelulares del cerebro de rata

1. Ensayo de actividad del proteasoma

NOTA: La actividad del proteasoma se puede medir en tejido cerebral homogeneizado utilizando una versión ligeramente modificada del Kit de Actividad del Proteasoma 20S. Este ensayo no mide directamente la actividad de los complejos completos del proteasoma 26S. Más bien, mide la actividad del núcleo 20S, lo que significa que solo puede servir como un proxy para comprender la actividad del núcleo en sí mismo en lugar de todo el complejo del proteasoma 26S. El éxito de este ensayo disminuye con los repetidos ciclos de congelación-descongelación y/o el aumento de los niveles de detergentes, especialmente iónicos, y requiere el uso de un lector de placas con un conjunto de filtros 360/460 (excitación/emisión) y capacidades de calentamiento de hasta 37 °C.

1. Ajustes del lector de placas: Precalentar a 37 °C y mantener pulsado durante el recorrido.​
   1. Establezca la excitación en 360 y la emisión en 460. Si la placa de 96 pocillos utilizada está despejada, establezca la posición de la óptica en Inferior. Si se utiliza una placa de 96 pocillos oscura/negra, establezca la posición de la óptica en Superior.
   2. Configure los modelos más antiguos de lectores de placas en Auto-Gain en las opciones de lectura fluorescente; los modelos más nuevos están preconfigurados para esto. Programe una carrera cinética con un tiempo de 2 h, escaneando (lectura) cada 30 min.
2. Reconstituya el tampón de ensayo 10x provisto en el kit con 13,5 mL de agua ultrapura. Agregue 14 μL de 100 mM de ATP al tampón ahora 1x; Esto mejora significativamente la actividad del proteasoma en las muestras y mejora la fiabilidad del ensayo. El tampón final del ensayo 20S puede almacenarse en hielo o a 4 °C hasta que se necesite y sea estable durante varios meses.
3. Reconstituya el estándar AMC provisto en el kit con 100 μL de DMSO. Realice este paso en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el estándar es sensible a la luz.
4. Cree una curva estándar de AMC utilizando el estándar reconstituido, en la oscuridad o en condiciones de poca luz.
   1. En tubos de microcentrífuga separados de 0,5 mL, agregue 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 y 0 μL del estándar AMC, que corresponde a 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 y 0 μM de concentración de AMC.
   2. A estos tubos, en el mismo orden, agregue 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 y 100 μL de tampón de ensayo 20S. Esto crea una serie de concentraciones de AMC de alta a baja, que se utilizarán para la calibración del lector de placas y el análisis de la actividad del proteasoma en las muestras homogeneizadas.
   3. Guarde todos los estándares diluidos en hielo en la oscuridad hasta que los necesite.
5. Reconstituya el sustrato del proteasoma (Suc-LLVY-AMC) suministrado en el kit con 65 μL de DMSO. Realice este paso en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el sustrato es sensible a la luz. Cree una dilución 1:20 del sustrato del proteasoma en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando tampón de ensayo 20S. Guarde el sustrato diluido en hielo en la oscuridad hasta que lo necesite.
   nota: Por ejemplo, si la placa tendrá 10 muestras y 1 en blanco, necesitará suficiente sustrato diluido para 22 pocillos (con duplicados) a 10 μL por pocillo. Esto equivale a una necesidad de 220 μL + 30 μL para errores de pipeteo, lo que requiere 12,5 μL de sustrato y 237,5 μL de tampón de ensayo 20S.
6. Descongele las muestras deseadas (si están congeladas) y agregue una cantidad normalizada a una placa de 96 pocillos. Ejecute cada ejemplo por duplicados. La cantidad de muestra necesaria varía en función de la preparación del tejido. Generalmente, 10-20 μg es suficiente para cualquier fracción subcelular.
7. Lleve el volumen del pocillo de muestra a 80 μL con agua ultrapura. La cantidad añadida depende del volumen de muestra añadida. Por ejemplo, si la muestra 1 tenía 4,5 μL de proteína y la muestra 2 era de 8,7 μL, entonces la cantidad de agua necesaria será de 75,5 μL y 71,3 μL, respectivamente. En dos pozos separados, agregue 80 μL de agua sola; estos serán los Assay Blanks.
   nota: Con el fin de limitar los cambios en el volumen de proteínas debidos a errores de pipeteo, las concentraciones de proteínas se pueden normalizar a la muestra menos concentrada. Esto permitirá el uso del mismo volumen de muestra en todas las condiciones.
8. Agregue 10 μL de tampón de ensayo 20S a cada pocillo, incluidos los blancos de ensayo. En este caso, se recomienda una pipeta repetidora/automatizada para garantizar un volumen de ensayo constante en todos los pocillos.
9. Opcional: En esta etapa, introduzca manipulaciones in vitro si lo desea; esto requerirá que cada muestra tenga 2 pocillos adicionales por tratamiento, incluido el vehículo. Si es así, agregue 5-10 μL de fármaco/compuesto de interés a 2 de los pocillos de muestra y un volumen equivalente de control/vehículo a otros 2 pocillos. Coloque la placa en el lector de placas precalentado o en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos.
10. Apague las luces o entre en una habitación oscura. Agregue los 100 μL de patrones AMC diluidos a un pocillo nuevo; Cada estándar tendrá un solo pozo.
11. En la oscuridad, agregue 10 μL de sustrato de proteasoma diluido a los pocillos que contengan muestras y blancos de ensayo, pero no al estándar AMC. En este caso, se recomienda una pipeta repetidora/automatizada para garantizar un volumen de ensayo constante en todos los pocillos.
12. Coloque la placa en el lector de placas e inicie la ejecución cinética.
    nota: No es necesario que la placa esté bajo agitación constante durante el recorrido cinético, sin embargo, el usuario puede optar por hacerlo si lo desea
13. Al final de la ejecución cinética, exporte los valores fluorescentes brutos de 360/460 a Microsoft Excel.
    1. Promedie juntos los pocillos duplicados para cada estándar, cada muestra y el ensayo en blanco para los 5 escaneos. Los valores de fluorescencia bruto deben aumentar en todas las exploraciones de las muestras, pero permanecer estables (o disminuir ligeramente) para los patrones y los blancos de ensayo.
    2. Tome el promedio de pozo estándar AMC más alto y divídalo por la concentración conocida (20 μM). Divida este valor por la concentración de muestra utilizada en el ensayo para obtener el valor de AMC estandarizado. Para cada muestra y el promedio en blanco del ensayo, divida por el valor AMC estandarizado.
    3. Tome este valor final y divídalo por la concentración de muestra utilizada en el ensayo para obtener el valor normalizado para cada muestra y el ensayo en blanco. Haga esto para los 5 escaneos.
    4. Reste el valor normalizado de Assay Blank de cada valor de muestra normalizado para los 5 escaneos.