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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inducir la anestesia
- Anestesiar al ratón con ketamina (125 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) inyectados por vía intraperitoneal.
>2. Monitorización de constantes vitales cada 15 min
- Controle la temperatura, la frecuencia respiratoria y el color de la piel. El mouse debe sentirse caliente al tacto. La piel debe aparecer rosada y bien perfundida. La frecuencia respiratoria debe oscilar entre 50 y 70 respiraciones por minuto.
>3. Procedimientos prequirúrgicos
- Pesar a todos los ratones el día anterior a la inducción de la lesión.
- Esterilizar un conjunto de instrumentos quirúrgicos mediante autoclave para cada sujeto experimental. Esterilice el dispositivo de impacto antes de usarlo.
- Prepare una jaula de recuperación colocando una jaula limpia sobre una almohadilla térmica eléctrica configurada en la configuración "baja" y colocada de tal manera que los ratones puedan alejarse del calor una vez que estén ambulatorios.
- Configure el quirófano dentro de una campana de flujo laminar esterilizada.
- Coloque el marco de operación estereotáxico.
- Coloque el dispositivo de impacto en el marco estereotáxico.
- Ajuste el dispositivo de accionamiento con los parámetros biomecánicos deseados para la velocidad y el tiempo de permanencia.
nota: En este protocolo se describe una lesión cerebral grave utilizando una punta de impacto de 3 mm de diámetro a través de una craniectomía de 5 mm de diámetro con una velocidad establecida en 2,5 m/s y un tiempo de permanencia de 0,1 s. Se puede utilizar una amplia gama de parámetros biomecánicos para inducir el espectro completo de TCE.
- Póngase un nuevo equipo de protección personal y guantes estériles.
- Afeitar el pelaje del sitio operatorio con tijeras eléctricas.
- Aplique un ungüento oftálmico protector en los ojos del ratón para prevenir lesiones y sequedad de la córnea.
- Coloque el mouse en el quirófano.
- Prepare la piel con un exfoliante quirúrgico a base de yodo alternado con alcohol tres veces.
4. Aplicación del impacto cortical controlado
- Incisión en el cuero cabelludo 1 cm en la línea media con un bisturí exponiendo el cráneo.
- Coloque el ratón dentro de un marco quirúrgico estereotáxico asegurando los huesos temporales bilaterales entre las barras de la oreja en miniatura y bloqueando los incisivos dentro de una pinza de incisivos, creando una sujeción estable de tres puntos en la cabeza del ratón.
- Retraiga el cuero cabelludo lejos del sitio operatorio con un hemostático o pinzas de bloqueo para asegurarse de que el cuero cabelludo no entre en contacto con la broca durante la craneectomía.
- Identificar las suturas sagitales y coronales en el cráneo expuesto.
nota: Este protocolo centra la craniectomía 2 mm a la izquierda de la sutura sagital y 2 mm rostral a la sutura coronal.
- Realice una craneectomía con un taladro con una broca de trépano.
- Para realizar la craniectomía, primero active el taladro a máxima velocidad y luego aplique la broca de trépano perpendicular al cráneo en el sitio de la craniectomía.
- Aplique una presión suave y uniforme al taladro una vez que haya hecho contacto con el cráneo. Se sentirá un ligero "ceder" una vez que el taladro penetre a través del cráneo. No penetre en la duramadre subyacente
nota: Este protocolo utiliza una broca de trépano de 5 mm para realizar la craniectomía.
- Use fórceps y una aguja hipodérmica de calibre pequeño para quitar el colgajo óseo, exponiendo completamente la duramadre subyacente.
- Gire la punta del impactador en el campo operatorio y bájela hasta que haga contacto con la duramadre expuesta. Una vez que se produce el contacto, el sensor de contacto del instrumento emitirá un tono audible para alertar al cirujano de que se ha producido el contacto. Esto marcará el punto cero a partir del cual se establece la profundidad de deformación.
nota: Este protocolo utiliza una punta de impacto de 3 mm para generar una lesión grave. Se pueden usar puntas tan pequeñas como 1 mm para aplicar lesiones más localizadas.
- Retraiga la punta de impacto y ajuste la profundidad de impacto deseada bajando la posición del impactador en el marco estereotáxico.
nota: En este protocolo describimos una lesión severa ajustando la profundidad de deformación a 2 mm.
- Aplique la lesión activando el impactador en el dispositivo de accionamiento.
- Gire el dispositivo de impacto fuera del campo y retire al animal del marco estereotáxico.
>5. Cierre del sitio quirúrgico
- Controle el sangrado del cráneo y la superficie cortical lesionada con presión directa de un aplicador estéril con punta de algodón.
- Seque el cráneo con un aplicador estéril con punta de algodón.
- Cierre el cuero cabelludo sobre la craniectomía con un adhesivo quirúrgico disponible en el mercado o una sutura de monofilamento.
nota: En este protocolo se utiliza un adhesivo quirúrgico veterinario para cerrar el cuero cabelludo. El colgajo óseo no se reemplaza y se desecha.
>6. Cuidados y seguimiento postoperatorio
- Administrar analgesia postoperatoria (p. ej., buprenorfina de liberación sostenida 0,1-0,5 mg/kg administrada por vía subcutánea que proporciona 72 h de analgesia sostenida).
- Coloque al animal en la posición de recuperación lateral del decúbito en una jaula limpia y precalentada.
- Observe a los animales hasta que estén despiertos y móviles, luego devuelva cada ratón a su jaula de origen.
- Garantizar el libre acceso a alimentos y agua. La ingesta normal de alimentos y agua generalmente se reanuda dentro de una o dos horas después de la lesión.
- Mide el peso corporal cada tres días durante todo el experimento.