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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por la revisión ética animal apropiada.
1. Preparación de reactivos
- Tampón de digestión (1 ml por hemisferio): Disuelva una mezcla estandarizada de enzimas digestivas purificadas, por ejemplo, Liberasa con baja concentración de termolisina (TL) a una concentración de 2U/ml en la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) que contiene calcio (Ca) y magnesio (Mg).
- Tampón de lavado con ADNasa: Disuelva la ADNasa I a una concentración de 666U/ml en HBSS (libre de Ca/Mg (calcio/magnesio)) que contiene un 10% de suero fetal de ternero (FCS).
- Tampón de lavado sin ADNasa: HBSS (libre de Ca/Mg) que contiene un 10% de FCS.
- Medio de gradiente de densidad (5 ml por hemisferio): prepare el medio de gradiente de densidad isotónico (SIP; 100%) mezclando nueve partes de medio de gradiente de densidad con una parte de cloruro de sodio 1,5 M. Diluya SIP hasta una densidad del 25% añadiendo un volumen adecuado de HBSS (libre de Ca/Mg) que contenga un 3% de FCS.
>2. Disociación del tejido cerebral en suspensiones unicelulares
- Retire con cuidado el tronco encefálico y el cerebelo con una cuchilla de afeitar limpia. Use una hoja de afeitar limpia para hemisectar el cerebro y corte cada hemisferio a lo largo del plano coronal en tres piezas de aproximadamente el mismo tamaño.
- Picar el tejido disecado de cada hemisferio a través de un colador de células de 100 μm utilizando el extremo del émbolo de una jeringa de 5 ml. Enjuague continuamente el colador de celdas con HBSS helado (+Ca/Mg). Almacene las muestras homogeneizadas en hielo.
- Centrifugar a 286 x g y 4° C durante 5 min, desechar cuidadosamente el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de tampón de digestión y transfiera la suspensión a un tubo de 2 ml. Incubar la suspensión bajo rotación lenta y continua a 37 °C durante 1 hora.
- Tamizar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm y enjuagar a fondo con 3 ml de tampón de lavado que contenga ADNasa, seguido de 15 ml de tampón de lavado sin ADNasa. Centrifugar a 286 x g y 18 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante. nota: El uso de la ADNasa elimina la mucosidad del ADN causada por la lisis celular, lo que podría conducir a la agregación celular, comprometiendo la supervivencia celular.
>3. Centrifugación en gradiente de densidad para la eliminación de mielina y restos celulares
- Vuelva a suspender el pellet celular en 5 ml de medio con gradiente de densidad del 25% y pipetee la suspensión en un tubo de 15 ml. Mezclar bien mediante pipeteo repetido y suave, evitando la formación de burbujas. nota: Se debe usar un medio de gradiente de densidad en RT para evitar la aglomeración de células.
- Centrifugar a 521 x g y 18 °C durante 20 min. Utilice el perfil de aceleración más bajo del rotor y deje que el rotor se detenga sin freno. Retire suavemente los tubos de la centrífuga sin agitarlos. Aspire cuidadosamente la capa de mielina y el sobrenadante mientras conserva la pastilla celular en el fondo del tubo. nota: Asegúrese de quitar toda la capa de mielina, ya que cualquier resto perjudicará el análisis de citometría de flujo.
- Vuelva a suspender el pellet en 10 ml de tampón de lavado sin DNAse y pipetee la suspensión en un nuevo tubo de 15 ml. nota: Este paso de lavado es crucial, ya que la eliminación suficiente del medio de gradiente de densidad contribuye significativamente a la cantidad y calidad de la muestra celular final.
- Centrifugar de nuevo a 286 x g y 10 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 100 μl de tampón de lavado en frío y determine los recuentos celulares y la viabilidad mediante la exclusión de azul de tripán en un hemocitómetro. Almacene las muestras a 4 °C y procéselas rápidamente.