Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de reactivos y suministros
- Determine el clorhidrato de éster metílico de L-3,4-dihidroxifenilalanina (levodopa o L-DOPA) y el clorhidrato de benserazida, un inhibidor periférico de la descarboxilasa (ver Tabla de Materiales), la frecuencia de clasificación y el cronograma experimental que sea apropiado para la pregunta de investigación (Figura 1)
nota: Se pueden plantear preguntas de investigación para buscar cualquier número de respuestas, que van desde preguntar si una terapia específica podría reducir las discinesias inducidas por L-DOPA (LID) existentes hasta prevenir la inducción de LID. También pueden explorar si la eficacia terapéutica depende de la dosis de levodopa o si la expresión de LID y/o la eficacia terapéutica varía según el sexo, la especie y la edad del sujeto.
- Pesar las ratas semanalmente para calcular la cantidad adecuada del fármaco en función de los cambios de peso continuos durante el estudio.
nota: Debido al aumento de la actividad en las ratas LID+, existe la posibilidad de perder peso con tratamientos a largo plazo con L-DOPA. Si se produce una pérdida de peso, proporcione a las ratas golosinas nutricionalmente completas y altamente palatables (consulte la Tabla de materiales) después de las inyecciones de L-DOPA.
- Calcular la cantidad de L-DOPA y benserazida necesaria para cada concentración semanal, pesando alícuotas liofilizadas para cada día de inyección y almacenando en combinación durante 1-2 semanas a -20 °C en viales de vidrio ámbar hasta el día del tratamiento.
nota: La dosis objetivo es de 12 mg/kg o 12 mg L-DOPA/1000 g de peso corporal. La información complementaria proporciona un ejemplo de cálculos para determinar la cantidad de L-DOPA y solución salina necesaria para cada día de la semana utilizando 12 mg de L-DOPA/kg de peso corporal a un volumen de inyección de 1 cc/kg de peso de rata.
>2. Montaje de la habitación y la jaula
- En el primer día de tratamiento con L-DOPA, 3-4 semanas después de la cirugía de lesión con 6-hidroxidopamina (6-OHDA), transfiera las ratas a un alojamiento individual, incluido el enriquecimiento aprobado por la IACUC.
- Manténgalo en una vivienda individual durante todo el estudio para evitar la interferencia de los compañeros con las evaluaciones de comportamiento.
- En los días de clasificación de LID, coloque las jaulas domésticas en una rejilla de alambre de acero, girada en un ángulo de aproximadamente 45° para una visualización óptima de la rata (Figura 2A). Voltee las etiquetas de identificación (Figura 2B) hacia arriba y retire las botellas de agua, los estantes de comida y todo tipo de enriquecimiento en la jaula (Figura 2C) para evitar interferencias con las evaluaciones de comportamiento.
>3. Inyecciones de levodopa y calificación de discinesia
- Inyecciones subcutáneas de L-DOPA
- Inmediatamente antes de la inyección diaria de L-DOPA, añadir el volumen adecuado de solución salina estéril a la mezcla de L-DOPA liofilizada y benserazida previamente pesada en el vial ámbar y agitar bien durante 10 s (paso 1.3).
NOTA: El volumen objetivo de inyección es de 1 mL/1000 g de peso corporal (con 12 mg de L-DOPA por mL). El volumen de la solución salina estéril dependerá del número de animales por estudio.
- Llene jeringas individuales (por ejemplo, 1,0 o 0,5 mL con aguja de 26 G) con el volumen requerido para cada animal (1 mL/kg de peso de rata) y etiquete cada jeringa con la identificación individual >
nota: Mantenga las jeringas llenas protegidas de la luz en bolsas estériles hasta el momento de la inyección. La L-DOPA se oxida rápidamente en presencia de oxígeno y luz en un ambiente acuoso.
- Lleve la primera jaula al banco de inyección.
- Retire la rata de su jaula y colóquela en la superficie de inyección.
- Sujete suavemente la cabeza y los hombros contra la superficie sobre la que descansa la rata con la palma de la mano no dominante.
- Frote suavemente la piel de la espalda que recubre las escápulas con el pulgar y el índice de la mano no dominante. A continuación, inyecte L-DOPA volumen con la mano dominante en el espacio subcutáneo entre los dedos, manteniendo la aguja lo más paralela posible al cuerpo para evitar la inyección intramuscular><.
nota: Las ratas no son anestesiadas antes de la inyección.
- Deseche cada jeringa individual usada en un recipiente afilado.
- Vuelva a colocar a la rata en su jaula individual y agregue golosinas nutricionalmente completas, excepto en los días de calificación LID, para evitar interferencias con las evaluaciones de comportamiento hasta después de que se completen las calificaciones.
- Configure el temporizador de 1 a 2 minutos según el tiempo de clasificación deseado y el número de ratas en el estudio en los días de calificación. Recupera la siguiente jaula e inyecta la siguiente rata cuando el temporizador lo indique.
- Repita esto, inyectando una rata cada 1 a 2 minutos, hasta que todas las ratas estén inyectadas.
- Índice de discinesia inducida por levodopa después de la inyección
- Califique la intensidad (Tabla 1) y la frecuencia (Tabla 2) de los movimientos de discinesia distónica e hipercinética en el número deseado de puntos de tiempo, que deben incluir el inicio inicial del comportamiento de LID, el comportamiento máximo y la fase de declive.
- Para ratas adultas macho y hembra Sprague Dawley o Fisher 344, y un tamaño de muestra de N = 40 ratas, comience las calificaciones de discinesia 20 minutos después de la primera inyección de L-DOPA, y luego a intervalos de 50 minutos hasta 220 o 270 minutos después de la inyección, dependiendo de cuándo los comportamientos de LID hayan disminuido en el 90%-100% de las ratas.
- Si usa intervalos de calificación de 1 minuto, programe un temporizador para 1 minuto. Evalúe a la primera rata durante un minuto. Pasa a la siguiente rata y califícala durante 1 min. Continúe a través de todas las ratas, calificando durante intervalos de 1 minuto.
- Tener un temporizador colocado al lado de la jaula de manera visible para que se pueda observar la intensidad del comportamiento de LID (Tabla 1) mientras se estima la frecuencia de cualquier comportamiento dado (Tabla 2) durante el período de calificación.
- Después de completar las calificaciones para el primer punto de tiempo, comience de nuevo con la primera rata en el siguiente punto de tiempo (por ejemplo, 70 minutos después de la inyección) y continúe en el intervalo deseado (por ejemplo, cada 50 minutos) hasta que se completen todos los puntos >nota: Debido a la superposición de las tareas de inyección de L-DOPA y calificación de LID, se necesitan dos personas en los días de calificación, una para inyectar y otra para las calificaciones de comportamiento.
