Detección del envejecimiento neuronal en una sección de organoides corticales

Resumen

Fuente: Shaker, M. R., et al. Generación robusta y altamente reproducible de organoides cerebrales corticales para modelar la senescencia neuronal cerebral in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra el método de detección de neuronas envejecidas en secciones de organoides corticales mediante tinción para la actividad de la beta-galactosidasa, que está elevada en las células senescentes. La enzima escinde un sustrato para producir un producto azul, seguido de una observación microscópica de las neuronas teñidas.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Caracterización del envejecimiento neuronal en organoides corticales

1. Organoides corticales de proceso para criosecciones:
   nota: Los pasos se realizaron en una campana de bioseguridad Clase 2.
   1. Prepare tubos de 2 ml, cada uno lleno con 1,5 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%.
   2. Corte el extremo de una punta de pipeta P1000 (para que quede de diámetro ancho) y transfiera suavemente cada organoide a uno de los tubos de 2 ml preparados anteriormente (un organoide por tubo).
      nota: Para evitar que el medio de diferenciación (DM) se mezcle en exceso con el PFA, deje que el organoide se hunda hacia la abertura de la punta de la pipeta P1000 y apoye la punta justo por encima de la parte superior del PFA en el tubo antes de pipetear el organoide. Esto permitirá al investigador transferir solo el organoide y un medio muy mínimo.
   3. Deje que el proceso de fijación se realice a 4 ° C durante 1 h.
   4. Con una punta de pipeta P1000 sin cortar, aspire cuidadosamente el exceso de PFA y añada 1,5 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) 1x fría.
   5. Transfiera los tubos a un agitador orbital ajustado a 70 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
   6. Repita el proceso de lavado con 1x PBS frío tres veces para asegurarse de que todo el PFA se haya eliminado completamente.
      nota: No deseche PFA en contenedores de residuos regulares; en su lugar, prepare un contenedor específico de eliminación de desechos químicos para esto, ya que el PFA es un peligro.
   7. Sumerja los organoides en 1x PBS que contenga un 30% de sacarosa e incube a 4 °C hasta que todos los organoides se hayan hundido hasta el fondo del tubo.
      nota: El tiempo necesario para que los organoides se hundan depende de su tamaño y edad. Los organoides de tres meses pueden tardar hasta 5 horas.
   8. Con una punta de pipeta P1000 cortada y de diámetro ancho, transfiera suavemente de tres a cinco organoides a un molde de montaje que contenga una solución de montaje hecha de un 30 % de sacarosa y un medio de temperatura de corte óptima (OCT) del 100 % en una proporción de 3:2.
   9. Utilice una punta de pipeta de 10 μL con la ayuda de un microscopio estereoscópico para orientar y posicionar los organoides en un patrón similar a una cuadrícula.
   10. Coloque el molde sobre hielo seco para solidificar la solución de OCT de sacarosa antes de proceder con el corte criogénico (16-20 μm) con un criostato.
       nota: En el caso de la beta-galactosidasa asociada a la senescencia, todos los tejidos deben procesarse para seccionarlos una vez que se hayan hundido. Para la inmunofluorescencia, los tejidos se pueden procesar para seccionarlos al día siguiente. Si no se tiñen inmediatamente, todos los portaobjetos que contengan secciones deben almacenarse a -20 °C antes de la inmunofluorescencia posterior o de la beta-galactosidasa.
2. Proceso para el análisis de la senescencia en los organoides cerebrales corticales:
   nota: Los siguientes pasos se pueden realizar en una mesa de laboratorio normal.
   1. Transfiera los portaobjetos a un recipiente de tinción de portaobjetos de microscopio con tapa y lave el tejido organoide seccionado tres veces con 1x PBS durante 10 minutos a RT para eliminar cualquier exceso de solución de montaje.
   2. A continuación, incubar el tejido lavado con una solución de tinción de beta-galactosidasa recién hecha durante la noche a 37 °C.
      nota: La solución de tinción de beta-galactosidasa está hecha de tampón fosfato (para 10 mL de tampón fosfato: 8,15 mL de 1 M NaH₂PO₄, 1,85 mL de 1M Na₂HPO₄) pH ajustado = 6, 100 mM de hexacianoferrato de potasio (III), 100 mM de hexacianoferrato de potasio (II) trihidratado, 5 M de NaCl, 1 M de MgCl₂, 20 mg/mL de X-Gal. Evite el uso de una incubadora de cultivo celular estándar que contenga CO₂, ya que el CO₂ alterará el pH de la solución de tinción de beta-galactosidasa.
   3. Para eliminar la solución de beta-galactosidasa, lavar los tejidos teñidos con 1x PBS tres veces durante 10 minutos cada una a RT.
   4. Monte los pañuelos lavados con un soporte antidecoloración de vidrio y deje que la solución de montaje se solidifique durante 30 minutos en RT antes de verlos bajo el microscopio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
16% Formaldehído (W/V) Libre de metanol	Thermo Fisher Scientific	28908	4% de PFA se diluye en 1x PBS
Microscopio CKX53 con cámara SC50	Olimpo
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Medio Neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Usado en medios DM
OCT Compuesto de Inclusión Sakura Clear (118 mL/botella)	Tejido Tek	4583
Hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato	Sigma Aldrich Pty Ltd	CP1087
Hexacianoferrato de potasio(III)	Sigma Aldrich Pty Ltd	455946
Prolongar el vidrio antidecoloración Mountant	Life Technologies Australia (TFS)	P36980
Sacarosa	Sigma Aldrich Pty Ltd	PHR1001-1G	El 30% de la sacarosa se diluye en 1x PBS