Convulsiones inducidas por la manipulación en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Batot, G., et al. Un modelo para la epilepsia de etiología infecciosa utilizando el virus de la encefalomielitis murina de Theiler. J. Vis. Exp. (2022).

Este video muestra la inducción de convulsiones inducidas por la manipulación en un ratón infectado con el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV). El ratón infectado, que tiene neuronas hiperexcitables, está expuesto a estímulos físicos externos. Esta exposición causa estrés, lo que conduce a una actividad eléctrica anormal en las neuronas, lo que resulta en convulsiones.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inoculación del virus

1. Esterilización de la jeringa inyectable
   1. Retire la tapa de la jeringa de insulina. Añada un tubo de polietileno a modo de collar alrededor de la aguja para garantizar una profundidad de inyección adecuada de 2,5 mm. Sumerja la jeringa en etanol durante 30 min. Coloque la jeringa bajo luz ultravioleta durante 30 minutos.
   2. Vuelva a colocar la tapa en la aguja. Envuelva la jeringa en una bolsa esterilizadora y ciérrela con cinta adhesiva. Etiqueta con la fecha de preparación.
2. Inyección de virus
   1. Obtenga alícuotas de la cepa de TMEV de Daniel del congelador a -80 °C. Descongele el virus y manténgalo en hielo. Evite descongelar y volver a congelar el virus. Cargue la jeringa con la suspensión del virus (unidad formadora de placas [PFU] 3 x 10⁵ diluida en 20 μL de solución salina tamponada con fosfato [PBS] o medio de cultivo Eagle modificado [DMEM] de Dulbecco).
      PRECAUCIÓN: El virus es infeccioso para los ratones, pero no para los humanos.
   2. Limpie el banco con un desinfectante y trabaje debajo de un absorbedor de humos. La inoculación del virus no es estéril, sino que es lo más limpia posible.
   3. Transfiera el ratón a la cámara de inducción de anestesia y use isoflurano al 2% en oxígeno para inducir la anestesia. Alcanzar la tolerancia quirúrgica lleva unos minutos; Ajuste la concentración en función de la respiración del animal y la profundidad de la anestesia.
   4. Transfiera el ratón anestesiado de la caja de anestesia debajo del capó. Comprobar la tolerancia quirúrgica, por ejemplo, mediante un pellizco en el dedo del pie. Todo el procedimiento se realiza en menos de 30 s, por lo que no es necesario que el animal inhale isoflurano durante la inyección. Agregue ungüento para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea.
   5. Limpie la cabeza del animal con una almohadilla con alcohol. Incline la cabeza del ratón ligeramente hacia la izquierda para que el lugar de la inyección apunte hacia arriba.
   6. Tire de la piel un poco hacia atrás, inserte la aguja en la cabeza e inyecte 20 μL por vía intracortical a una profundidad de 2,5 mm en la región temporal del hemisferio derecho (posterior y medial al ojo derecho).
   7. Realizar la inyección unilateralmente en el mismo hemisferio en todos los animales. Utilice el ojo y el oído como puntos de referencia para la ubicación de la corteza parietal. La colocación ha sido previamente verificada histológicamente; véase la figura 1. Las coordenadas de inyección según la inyección estereotáxica en relación con bregma son −2,0 (AP); +3.0 (ML); -1,5 (DV).
   8. Deje la jeringa en su lugar durante 5-15 s. Anote si hay alguna fuga de la inyección o si se ven burbujas de aire; en ese caso, prepare una jeringa nueva. Cuando saque con cuidado la jeringa, gírela ligeramente. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
   9. OPCIONAL: Codifique al animal en la cola o en la oreja dependiendo de los procedimientos locales (opcional pero fácil ya que el animal está inconsciente).
   10. Transfiera al animal a una nueva jaula, que se coloca mitad sobre / mitad sin una almohadilla térmica (35-40 ° C) durante la recuperación de la anestesia. No deje a los animales desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
       nota: Los animales pueden volver a ser alojados en grupo después de la recuperación (los animales infectados no se mezclan con animales infectados simulados). Los ratones infectados no deben alojarse en la misma habitación que los ratones no infectados.
   11. Lleve un registro del peso de los ratones durante los primeros 7 días después de la infección, ya que pierden peso después de la infección y pueden requerir alimentación adicional.

2. Monitoreo de convulsiones inducidas por manipulación

1. Realice este procedimiento con un experimentador ciego al tratamiento. Lleva todas las jaulas al banco. Observe a los animales en busca de convulsiones 2 veces al día durante la fase de luz.
2. Puntúe la actividad convulsiva mediante una escala de Racine modificada: 0 = sin cambios en el comportamiento, 1 = movimientos bucales y faciales, 2 = cabeceo, 3 = clonus unilateral de las extremidades anteriores, 4 = clonus bilateral de las extremidades anteriores con la cría, 5 = actividad tónico-clónica generalizada con pérdida del tono postural, a veces saltando, 6 = saltos prolongados y excesivos e hiperactividad. Reportar el número y la intensidad de las convulsiones.
3. Desliza un bolígrafo por la jaula para hacer un poco de ruido.
4. Transfiera cada animal a otra caja y viceversa.
5. Agite suavemente la jaula con un movimiento hacia adelante y hacia atrás, teniendo cuidado de no agitar la jaula tan vigorosamente que los animales golpeen los lados o la parte superior de la jaula y corran el peligro de sufrir lesiones físicas.
6. Vigile a todos los animales en la jaula para detectar convulsiones. En cualquier momento, si un ratón tiene una convulsión, transfiéralo de nuevo a la jaula doméstica y anote el nivel de la convulsión sin más estimulación de convulsiones por ruido o manipulación.
7. Para los animales que no han convulsionado espontáneamente o después de agitar suavemente la jaula, desencadene las convulsiones mediante una manipulación más intensa: Gire con cuidado al ratón volteándolo por la cola de izquierda a derecha.
   nota: Los animales con convulsiones son hiperexcitables y pueden estar nerviosos.
8. Observe de nuevo a cada animal para ver si tiene comportamientos convulsivos. Repita el proceso para las jaulas subsiguientes.

Resultados

Figura 1: Esquema del procedimiento de inyección de TMEV. De izquierda a derecha: Para una inyección en la corteza parietal derecha, la aguja se inyecta ligeramente lateral de una línea imaginaria entre el ojo y el oído opuesto. El collar para el control de profundidad está indicado en amarillo. El tracto de inyección se puede ver en la sección coronal del cerebro, marcada con la flecha. El lugar de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equilibrio animal	Ohaus (Parsippany, Nueva Jersey, EE. UU.)	STX2202	0,01 g–2200 g
BD Lo-Dose U-100 Jeringas de Insulina	BD (Mississauga, ON, Canadá)	BD329461	Jeringas estériles Lo-Dose con aguja intravenosa permanente BD Micro-Fine - 1 mL
La cepa de Daniel de TMEV	amablemente proporcionado por Robert Fujinami (Universidad de Utah)	-	3 x 105 unidades formadoras de placas alícuota(s)
Desinfectante, p. ej. VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Alemania	-	Recomendado por los veterinarios del campus con menos o igual a 5% de alcohol
Almohadilla de preparación con alcohol estéril mediana Fisherbrand C7	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EE. UU.)	22-363-750
Fluriso	VETone (Boise, ID, EE.UU.)	502017	Isoflurano 250 mL, 2%–5%
Absorbedor de humos	Labconco (Kansas City, Missouri, EE.UU.)	-	-
Batas de laboratorio blancas desechables SMS de protección general	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EE. UU.)	17-100-810A
Cubo de hielo	-	-	cualquiera
Jaula de ratones	-	-	cualquier jaula de ratón que contenga al menos 5 ratones
Agujas PrecisionGlide	BD (Mississauga, ON, Canadá)	329652	Punta deslizante BD con jeringas de insulina con aguja PrecisionGlide - 26 g x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Bolsa esterilizante autosellante	Fisher Scientific (Hampton, Nueva York, EE. UU.)	NC9241087	12.6 x 25.5 cm
Frasco de vidrio pequeño	-	-	cualquiera, volumen 25 mL
PBS estéril	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EE. UU.)	10010056
Jeringa Luer-Lok	BD (Mississauga, ON, Canadá)	309628	Jeringa de 1 mL solamente
Limpiador ultrasónico, calentador/temporizador mecánico	Cole-Parmer (Vernon Hills, Illinois, EE.UU.)	EW-08895-23	Sonicador de baño - 0,5 gal, 115 V