Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de la solución de lisofosfatidilcolina (LPC)
- Disuelva 25 mg de polvo de LPC (consulte la tabla de materiales) con 250 μL de solución mixta de cloroformo y metanol (1:1) para hacer una solución de LPC al 10% y transfiérala a un tubo de centrífuga de 500 μL.
NOTA: Si el LPC no se disuelve completamente, coloque el tubo de centrífuga en un limpiador ultrasónico y ultrasonido a 40 kHz durante ~1 h para obtener una solución uniforme.
- Divida la solución en 3 μL/tubo y almacene a -80 °C.
NOTA: La solución se puede almacenar durante ~ 2 años.
- Antes de la cirugía, diluir la solución (paso 1.2) con 27 μL de solución de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% y mantener la solución en un baño de agua a temperatura constante a 37 °C.
NOTA: Prepare la solución justo antes de comenzar la inyección.
2. Preparación quirúrgica
- Use una aguja de 32 g y 2 pulgadas para conectarla a una jeringa de 5 μL (consulte la tabla de materiales). Asegúrese de que la jeringa de microlitros no esté obstruida. Extraiga 5 μL de solución de LPC para preparar la inyección.
- Anestesiar al ratón en una cámara de inducción conectada a un vaporizador de isoflurano con un 3% de isoflurano mezclado con un 100% de oxígeno a una tasa de aproximadamente 0,3 L/min.
- Confirme la profundidad de la anestesia por la falta de reflejo de pellizco de los dedos del pie mientras la respiración es suave.
- Afeita la cabeza del ratón entre las orejas con una afeitadora eléctrica. Aplique gotas lubricantes para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea durante el procedimiento.
- A continuación, coloque el ratón en un marco estereotáxico (consulte la tabla de materiales) con el lado dorsal hacia arriba y asegure la cabeza con un cono de nariz y una pinza para los dientes. Mantener la anestesia con isoflurano al 1,2%-1,6% a través de la nariz.
nota: La concentración de isoflurano se puede ajustar de acuerdo con el estado respiratorio de los ratones.
3. Procedimiento quirúrgico
NOTA: Los animales se colocan sobre una almohadilla térmica durante todos los procedimientos.
- Fije el ratón al aparato estereotáxico con barras bilaterales en los oídos. Asegúrese de que las barras de los oídos estén niveladas y que la cabeza esté horizontal y estable.
- Desinfecte la piel de la cabeza limpiándola varias veces con yodo, seguido de alcohol con movimientos circulares. A continuación, se utiliza un bisturí para hacer una pequeña incisión de unos 1,5 cm a lo largo de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.
- Limpie el cráneo con un hisopo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno al 1% hasta que el bregma, la lambda y la fontanela posterior queden expuestos. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxico.
NOTA: Use el peróxido de hidrógeno con cuidado y evite tocar los tejidos circundantes.
- Asegurar la posición horizontal de la cabeza del animal (tanto delante como detrás, izquierda y derecha).
- Ajuste la perilla del eje Z del marco estereotáxico para que la punta de la aguja y el cráneo se toquen sin doblarse, luego mida la coordenada del eje Z. Compruebe las coordenadas Z del bregma y la fontanela posterior.
- Ajuste la barra de la oreja para que la diferencia entre las coordenadas Z del bregma y la fontanela posterior no sea superior a 0,02 mm. Luego, siga el mismo método para medir las coordenadas Z de las posiciones correspondientes en los lados izquierdo y derecho de la línea media. Ajuste la barra de la oreja para asegurarse de que la izquierda y la derecha estén al mismo nivel.
- Localiza el cuerpo calloso. Establezca el origen XYZ en bregma.
NOTA: El primer sitio de inyección es de 1,0 mm lateral a la brema, 2,4 mm de profundidad y 1,1 mm anterior. El segundo sitio de inyección es de 1,0 mm lateral a la brema, 2,1 mm de profundidad y 0,6 mm anterior. Por ejemplo, la coordenada del bregma es (0,0,0). Mida la coordenada Z de la ubicación correspondiente marcada como (-1, 1.1, X) y (-1, 0.6, Y). Se puede determinar que la primera coordenada del sitio de inyección del cuerpo calloso es (-1, 1.1, -[X + 2.4]), y el segundo sitio de inyección es (-1, 0.6, -[Y + 2.1]).
- Una vez determinado el lugar de la inyección, haga una marca con un marcador estéril en el cráneo y registre las coordenadas.
- Taladre suavemente el sitio marcado con un taladro de cráneo (consulte la Tabla de materiales). Tenga cuidado de evitar cualquier sangrado.
- Mueva lentamente la aguja a las coordenadas dadas e inicie la inyección. Para inducir la desmielinización del cuerpo calloso, inyectar 2 μL de solución de LPC (paso 1.2) en cada lugar de inyección (paso 3.5.) a razón de 0,4 μL/min.
- Después de la inyección, mantenga la aguja en cada sitio durante 10 min.
NOTA: Asegúrese de que el intervalo de dos inyecciones no sea superior a 20 minutos.
- Suturar la piel con una sutura 4-0 y esperar a que el animal se despierte en 10 min. Administrar analgésicos en el postoperatorio de acuerdo con las normas institucionales de cuidado de animales.
NOTA: El tiempo recomendado para la eutanasia se puede determinar de acuerdo con el propósito del experimento.