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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de soluciones de hemoglobina y LCR
- Prepare una solución estéril de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) añadiendo 500 μL de la solución de aCSF a un microtubo de 1,5 mL y guárdela en hielo.
- Prepare una solución estéril de hemoglobina de 150 mg/mL añadiendo 75 mg de hemoglobina a 500 μL de líquido hemogloboso en un microtubo de 1,5 mL y guárdela en hielo.
2. Preparación del animal para la inyección
- Gira la almohadilla térmica a la posición media para mantener la temperatura corporal de la rata.
- Anestesiar ratas postnatales día 4 (P4) en una cámara de inducción llena de isoflurano al 3%
nota: Confirme la presencia de anestesia suficiente utilizando la respuesta de pellizco de la punta del pie o la cola cada 15 minutos. Controle la anestesia con observación visual del color del tejido, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria.
- Administrar analgésicos con una inyección subcutánea de carprofeno de 5 mg/kg a la rata anestesiada.
- Colocar la rata anestesiada boca abajo en el aparato estereotáxico con la nariz colocada en el adaptador de anestesia con un flujo constante de isoflurano al 1,5%.
- Apriete las barras de la oreja que no se rompen en el meato auditivo externo para asegurar la cabeza.
nota: Aplique ungüento veterinario para mantener los ojos humectados si los ojos están abiertos a la edad de la inyección.
- Limpie el cabezal, alternando con aplicadores estériles con punta de algodón empapados en betadine y etanol al 70%.
- Toque el aplicador empapado en betadine en el centro del cuero cabelludo y extienda el betadine en círculos, moviéndose hacia afuera.
- Repita el paso 2.6.1.1 con el aplicador empapado en etanol.
- Repita los pasos 2.6.1.1 y 2.6.1.2 3 veces.
- Aplique un paño quirúrgico estéril para proteger el campo quirúrgico.
- Con un bisturí estéril, haga una incisión vertical de 0,3 cm en el centro de la cabeza para exponer el bregma del cráneo><.
nota: Si inyecta desde la lambda, exponga la lambda del cráneo en lugar de la bregma.
- Use un aplicador estéril con punta de algodón para secar el área.
3. Configuración del inyector estereotáctico
- Extraiga la solución >nota: Si genera condiciones de control, extraiga una solución de LCR preparada en el paso 1.1 en una jeringa estéril de 0,3 mL y proceda con el protocolo.
- Encienda la interfaz del inyector estereotáctico y haga clic en el botón Configuración para ingresar la configuración del volumen y la velocidad de inyección.
- Haga clic en Volumen y ajuste el volumen a 20.000 nL (20 μL).
- Haga clic en Velocidad de infusión y establezca la tasa en 8.000 nL/min (8 μL/min).
- Salga de la configuración haciendo clic en el botón Restablecer POS.
- Enjuague la punta de la aguja haciendo clic en el botón Infundir hasta que emerja una pequeña gota de solución de hemoglobina en la punta de la aguja.
- Absorba suavemente la solución de hemoglobina de la punta de la aguja con un aplicador estéril con punta de algodón.
4. Inyección animal
- Establezca el bregma en cero en el sistema de inyectores estereotácticos ajustando las posiciones mediolateral y anteroposterior de la jeringa antes de bajar la punta de la aguja de la jeringa enjuagada para tocar suavemente el cráneo en el bregma.
nota: Si inyecta desde la lambda, establezca lambda como cero.
- Identifique las coordenadas de su elección.
- Si se inyecta desde el bregma, en las ratas P4 descritas aquí, use 1,5 mm lateral, 0,4 mm anterior y 2,0 mm de profundidad del bregma.
- Si inyecta desde la lambda, utilice las siguientes coordenadas para las ratas P4: 1,1 mm lateral, 4,6 mm anterior y 3,3 mm de profundidad desde la lambda.
- Levante la aguja de la jeringa 1 cm por encima del cráneo para despejar el cuero cabelludo. Cuando la jeringa esté levantada, proceda a establecer las coordenadas mediolateral y anteroposterior.
- Baje la aguja de la jeringa para tocar suavemente el cráneo. Compruebe que la aguja esté tocando el cráneo.
- Establezca la coordenada dorsoventral en un período de 30 s.
nota: Al establecer la coordenada dorsoventral, la aguja perforará el cráneo. Se debe tener cuidado para asegurar que la jeringa pase a través del cráneo sin deformarlo. La deformación del cráneo se evita retirando lentamente la aguja a lo largo de la coordenada dorsoventral si se produce deformación, y luego colocando la aguja de nuevo a lo largo de la misma trayectoria. Esto permite que la aguja pase a través del orificio en el cráneo con menos fuerza y sin deformación.
- En la interfaz del inyector estereotáctico, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la inyección.
- Una vez finalizada la inyección, deje la aguja de la jeringa en su lugar durante 2 minutos para minimizar el reflujo de la solución.
- Retire la jeringa lentamente a lo largo de la coordenada dorsoventral durante 2 minutos hasta que la punta de la aguja esté a 2 cm por encima del cuero cabelludo.
- Gire el brazo del inyector estereotáctico lejos del campo operatorio.
5. Cuidados postoperatorios
- Cerrar el cuero cabelludo con una sutura monofilamento 6-0. Haga una sutura interrumpida simple en el centro de la incisión de 0,3 cm.
- Retire al cachorro de la anestesia y colóquelo en un área segura sobre la almohadilla térmica.
- Regrese el roedor a la jaula de la casa para que se recupere de la anestesia bajo el cuidado de su madre.
nota: El retorno oportuno al cuidado de la madre reduce la mortalidad postoperatoria precoz.
- Monitorizar los animales para la anestesia mediante la pérdida del reflejo de enderezamiento cada hora después de la cirugía durante 3 h.
- Monitoree a los animales diariamente durante 7 días para determinar la actividad normal, la ingesta de alimentos y el aumento de peso. Monitoree el sitio de la incisión para ver si la herida ha cicatrizado, cerrado y reaparecido el pelaje en el sitio de la cirugía.
nota: En el raro caso de que se observen cambios neurológicos como convulsiones, depresión central o disminución del apetito durante el monitoreo, eutanasiar al animal mediante perfusión intravascular o luxación cervical bajo anestesia.
- Para prevenir la infección una vez que la sutura esté cerrada y la herida esté cicatrizando, aplique un antibiótico triple tópico en el sitio de la incisión.