Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación para el ensayo de convulsiones inducidas por calor
- Encienda el botón de encendido en la cámara de calor, seguido del botón de encendido de calor.
- Ajuste la temperatura de la cámara de calor a 50 °C con el teclado del controlador de temperatura digital.
- Espere un mínimo de 1 h para precalentar la cámara a 50 °C antes de introducir el primer ratón en la cámara. El precalentamiento garantiza un calentamiento uniforme dentro de la cámara.
- Cubra el piso de la cámara de calor del ratón con ropa de cama de mazorca.
- Monte una cámara de grabación de video frente a la cámara de calor para grabar cada ensayo de ensayo de convulsiones inducidas por calor.
- Cubra una placa de Petri de 140 mm de diámetro con capas gruesas de papel de seda y colóquela sobre hielo para que sirva como almohadilla de enfriamiento.
nota: Al final del ensayo, los ratones individuales se transferirán a la almohadilla de enfriamiento preenfriada para ayudar a reducir su temperatura corporal elevada.
2. Preparando al ratón para el ensayo de convulsiones inducidas por calor
- Seleccione 10 ratones adultos (P30-P40), 5 que porten la mutación causante de la epilepsia y 5 de los compañeros de camada de tipo salvaje para el ensayo de detección de convulsiones inducidas por el calor><.
nota: Los ratones de tipo salvaje, que no albergan ninguna mutación causante de epilepsia, no presentan convulsiones inducidas por el calor a temperaturas inferiores a 44 °C y sirven como grupo de control.
- Pese cada ratón que se utilizará para el ensayo de detección y registre su peso corporal. Solo se deben utilizar ratones que pesen 15 g o más para el ensayo.
- Proyecte un mouse a la vez en la cámara de calor del mouse.
- Anestesiar brevemente al ratón durante 10-15 segundos usando unas gotas de isoflurano en el fondo de una campana
.
- Saca al animal de la campana y colócalo sobre una toalla de papel.
- Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado comprobando que el ratón no responde a un pellizco nocivo en el dedo del pie.
- Cubra la punta metálica de la sonda de temperatura rectal con un lubricante (como vaselina) e insértelo suavemente en el ratón a una profundidad inferior o igual a 2 cm.
- Asegure la sonda rectal a la cola del ratón con cinta adhesiva para que la sonda no se salga durante el ensayo.
nota: Alternativamente, coloque al animal en un cono de restricción para ratones e inserte la sonda de temperatura rectal. Asegúralo pegándolo con cinta adhesiva a la cola.
- Asegúrese de que la sonda rectal esté conectada a un multímetro que muestre la temperatura corporal interna del ratón.
- Coloque al animal en una jaula fresca forrada con ropa de cama de mazorca, es decir, la jaula de recuperación.
- Inicie un temporizador y espere 5 min. Observe al ratón hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia y el ratón esté activo y acicalándose.
- Al mismo tiempo, controle la temperatura corporal central del ratón hasta que se estabilice a 35-36 °C.
- Al final de 5 minutos, observe la temperatura corporal del ratón. Esta es la temperatura corporal inicial en el tiempo "0" min.
nota: Si la temperatura corporal central del ratón es inferior a 35 °C, espere un tiempo adicional para que el animal se recupere de la hipotermia inducida por la anestesia.
- Transfiera rápidamente el ratón individual a la cámara del ratón precalentada. Esto marca el INICIO de la prueba del experimento. Solo se proyecta un mouse a la vez.
3. Ensayo de convulsiones inducidas por calor
- Después de colocar suavemente el ratón en el suelo de la cámara de calor precalentada, cierre la puerta de plexiglás e inicie la cámara para grabar el experimento.
- Pon en marcha el cronómetro. Registre la temperatura corporal del ratón desde el termómetro rectal a intervalos de 1 minuto durante la duración del experimento.
- A intervalos regulares, aumente la temperatura de la cámara de calor del ratón de modo que la temperatura corporal del ratón aumente a un ritmo de 0,25-0,5 °C /min.
nota: Los aumentos rápidos de la temperatura corporal pueden provocar un golpe de calor o la muerte y deben evitarse.
- Siguiendo este protocolo, aumente la temperatura de la cámara de calor del ratón en 5 °C cada 10 minutos como se muestra en la Figura 1A.
- A los 9,5 minutos, ajuste la temperatura de la cámara de calor a 55 °C, para estabilizar la temperatura de la cámara de calor a 55 °C en el minuto 10 como se muestra en la pantalla digital de temperatura.
- Del mismo modo, aumente la temperatura a 60 °C a los 19,5 minutos para estabilizar la temperatura de la cámara de calor a 60 °C en el minuto 20. Cada prueba de detección de convulsiones dura 30 minutos.
- Si el ratón tiene una convulsión (vocaliza, muestra asentir con la cabeza, clonus de las extremidades anteriores, extensión de las extremidades posteriores, se cae de lado o experimenta convulsiones tónicas/clónicas generalizadas), registre la siguiente información.
- Registre la temperatura corporal del ratón durante la convulsión (temperatura umbral de la convulsión) desde el termómetro de temperatura rectal.
- Registre las características del comportamiento convulsivo, como asentir con la cabeza, clonus de las extremidades anteriores, extensión de las extremidades traseras, caídas de lado y/o convulsiones tónicas/clónicas generalizadas (GTCS) mostradas por el ratón.
- Levante rápida pero suavemente el mouse de la cámara y colóquelo en la almohadilla de enfriamiento preparada en el paso 1.6.
nota: Si un ratón experimenta convulsiones de escala 5 de Racine y muestra saltos incontrolados, puede ser difícil recoger al animal de la cámara de calor y transferirlo a la almohadilla de enfriamiento en el exterior. Sin embargo, una convulsión típica inducida por el calor dura entre 30 s y 60 s. Por lo tanto, el ratón debe ser sacado de la cámara de calor y colocado en la almohadilla de enfriamiento dentro de los 60 s posteriores al inicio del episodio de convulsión inducida por el calor.
- Espere a que la temperatura corporal del ratón baje a 36-37 °C, antes de transferirlo a una jaula de recuperación. Solo se coloca un ratón en una jaula de recuperación a la vez.
nota: No mezcle ratones que aún no se han utilizado para el cribado inducido por el calor con el ratón que ya ha experimentado el ensayo del experimento de convulsiones inducidas por el calor.
- Con cuidado y suavidad, corte la cinta entre la cola del ratón y el alambre de la sonda rectal con unas tijeras para quitar la sonda rectal del ratón.
- Limpie la punta metálica de la sonda rectal con alcohol al 70 % y toallitas de tejidos blandos para mantenerla lista para la próxima prueba.
- Continúe observando al ratón en la jaula de recuperación hasta que reanude su actividad normal (caminar, acicalarse, etc.), antes de devolverlo a su jaula de origen. Esto marca el FINAL de la prueba del experimento para este ratón.
- Registre el estado del animal después del ensayo: vivo y recuperado de la sesión de prueba o muerto. Las convulsiones de alta intensidad que involucran saltos incontrolados y convulsiones tónicas/clónicas generalizadas a veces pueden resultar en la muerte del ratón.
- Si un ratón no experimenta convulsiones inducidas por el calor dentro del período de observación de 30 minutos o si la temperatura corporal del ratón alcanza los 44 °C, retire el ratón de la cámara de calor y colóquelo en la almohadilla de enfriamiento hasta que la temperatura corporal del ratón vuelva a 36-37 °C.
- Restablezca la temperatura de la cámara de calor del mouse a 50 °C y deje que se equilibre hasta que la temperatura de la pantalla en el controlador de temperatura digital muestre 50 °C.
- Cambie la ropa de cama de mazorca entre pruebas individuales de ratones.
