Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Tinción del anticuerpo primario y biocitina
(Día 1)
NOTA: El siguiente procedimiento de inmunotinción es para secciones de flotación libre y requiere una agitación continua a baja velocidad (2 revoluciones/min, rpm) en un agitador para todos los pasos de incubación.
- Lave el pañuelo 3 veces durante 10 minutos cada una en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
NOTA: 0,1 M PBS se puede comprar comercialmente o fabricar en el laboratorio de la siguiente manera (rinde 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4 en 1 L de dH2O.
nota: Si se conoce el marcador neuroquímico deseado, la tinción de una proteína/péptido se puede realizar simultáneamente con la tinción de biocitotina (pasos 1.2 a 1.4). Si solo se tiñe para biocitina, continúe con el paso 1.5.
- OPCIONAL: Bloquear con Suero Bloqueador (SB) al 10%; Suero de cabra normal (NGS) diluido en Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 1 h en RT).
nota: Cada pocillo debe recibir el mismo volumen de solución; el volumen recomendado está entre 250 - 500 μL/pocillo. La selección del suero bloqueante se basa en la especie en la que se generan los anticuerpos secundarios (por ejemplo, la NGS se utiliza para los anti-(especies de anticuerpos primarios respectivas)). Si surge la necesidad de utilizar anticuerpos secundarios criados en diferentes especies para secciones de inmunotinción, incluir el 10% de cada suero normal en la etapa de bloqueo (2) y el 3% de cada suero normal para las etapas de incubación de anticuerpos primarios y secundarios.
- (OPCIONAL) Incubar las secciones en el anticuerpo primario, CB1R (policlonal, conejillo de indias), con 0,3% de Triton X-100 y 3% de BS en 0,1 M PBS en RT O/N. CB1R se utiliza para identificar la expresión del receptor cannabinoide tipo 1.
nota: Este paso es opcional y no es necesario para revelar el relleno de biocitina. La Figura 2 ilustra una sección marcada para biocitina y CB1R durante el primer proceso de tinción. La incubación de O/N en RT es suficiente para la mayoría de los anticuerpos primarios; sin embargo, ciertos anticuerpos primarios, incluido el CB1R, requieren de 3 a 5 días de incubación. Si la incubación debe durar más de 1 d, se recomienda incubar a 4 °C porque Triton X-100 puede permeabilizar las rodajas y puede provocar la desintegración del tejido durante una incubación prolongada a temperatura ambiente. Incluir un control negativo que carezca de un anticuerpo primario en al menos una sección para cada serie de experimentos como control de la especificidad del anticuerpo secundario. En el caso de los controles negativos, se omite el anticuerpo primario, pero se añade el Triton X-100 al 0,3% en PBS y BS de 0,1 M.
(Día 2)
- Lave las secciones del cerebro 3 veces durante 10 minutos cada una en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Incubar las secciones en colorante rojo de estreptavidina conjugado (concentración: 1:1.000; excitación: 594 nm con emisión en el espectro rojo visible) con 0,3% de Triton X-100 y 3% de BS en 0,1 M de PBS a 4 °C O/N en la oscuridad (envuelto en papel de aluminio) para revelar la biocitina. opcional: Incluya un anticuerpo secundario, anti-cobaya de cabra (concentración: 1:500; excitación: 488 nm y emisión en verde), con la incubación anterior siguiendo la incubación primaria opcional en el paso 1.3.
nota: Solo se necesitará un anticuerpo secundario si se realiza la tinción opcional de anticuerpos primarios (paso 1.3). Para visualizar la biocitina, se recomienda un conjugado estreptavidina-fluoróforo con un espectro de emisión en rojo, ya que ayuda a visualizar los axones más finos en detalle y con mejor contraste (Figuras 1 - 3).
(Día 3)
- Lave las secciones del cerebro 3 veces durante 10 minutos cada una en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Para proteger la fluorescencia y facilitar la retinción en el futuro, monte las secciones en un medio de montaje de base acuosa y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
nota: Es mejor volver a teñir las secciones lo antes posible para evitar dificultades para quitar el esmalte de uñas del portaobjetos, infestación de moho y deshidratación de los tejidos debido a la fuga del medio de montaje del portaobjetos de vidrio. La contaminación microbiana se puede prevenir mediante el uso de azida de sodio al 0,02% en PBS.
cautela: La azida sódica es altamente tóxica e inflamable cuando está en contacto con el agua. Consulte los procedimientos operativos estándar para el manejo y eliminación de productos químicos peligrosos.
(Días 4 - 7)
- Realice imágenes confocales con excitación a 594 y 488 nm y con un aumento de 20X o 40X para revelar neuronas llenas de biocitina en rojo y marcadores neuroquímicos (CB1R) en verde. Evalúe el coetiquetado (Figura 2).
- Ajuste la exposición de la cámara a menos de 100 ms para evitar el fotoblanqueo y obtener pilas de imágenes confocales de los ejes axonales y dendríticos de toda la neurona. Utilice pilas de imágenes confocales y paquetes de software de rastreo de neuronas para reconstruir la morfología neuronal.
