1. Preparación de las secciones de biopsias por succión rectal (RSB)
- Colocar las biopsias de succión rectal en paraformaldehído al 4% durante 6 h para fijar el tejido. Utilice un volumen fijador 5 veces más que el volumen del tejido.
- Deshidratar el tejido utilizando el deshidratador de tejidos patológicos durante 11 h. Todo el proceso programado consta de los siguientes 5 pasos:
- Coloque el pañuelo en formaldehído y fíjelo durante 1 h.
- Coloque el tejido en etanol al 75% durante 4 h.
- Coloque el tejido en etanol absoluto (dos cambios, 1 h cada uno).
- Coloque el tejido en etanol absoluto (dos cambios, 30 min cada uno).
- Coloque el tejido en xileno (tres cambios, 1 h cada uno).
- Colocar el pañuelo en cera de parafina (58-60 °C) (tres cambios, 1 h cada uno). Incruste los tejidos RSB en bloques de parafina.
- Recorte los bloques de parafina con un micrótomo hasta que el tejido quede completamente expuesto con un plano de sección completo.
- Corta los bloques en secciones de 0,4 μm con un micrótomo.
- Coloque las secciones en agua a 45-50 °C durante unos segundos cada una para permitir que las secciones se extiendan en una placa plana.
- Transfiera las secciones de parafina a los portaobjetos.
- Hornee los portaobjetos en un horno a 60 °C durante 3-5 h. Evite hornear durante demasiado tiempo, ya que puede provocar la pérdida de los antígenos.
- Coloque los portaobjetos desparafinados en xileno (2 cambios de 15 min cada uno).
- Hidrate los portaobjetos en etanol absoluto, etanol al 95%, 80% y 75% durante 5 minutos cada uno. Luego, enjuáguelos en agua purificada por ósmosis inversa (RO) durante otros 5 minutos.
2. Recuperación de antígenos
- Realice diluciones de trabajo para la recuperación de calretinina mezclando 4 mL de tampón de recuperación de antígenos de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) con 200 mL de agua purificada con ósmosis inversa. Realice diluciones de trabajo para la recuperación de S100 y Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) mezclando 1 mL de tampón de citrato de sodio de ácido cítrico (100x) con 99 mL de agua purificada con ósmosis inversa.
NOTA: La calretinina puede recuperarse preferentemente mediante una solución de recuperación con EDTA. Sin embargo, el tampón de citrato de sodio de ácido cítrico es más adecuado para la recuperación de S100 y PGP9.5.
- Coloque los portaobjetos en un frasco de tinción de coplin. Llene el frasco con solución de recuperación y colóquelo en un baño de agua hirviendo precalentado. Después de hervir durante 20 minutos, retira el frasco del baño de agua y déjalo enfriar a temperatura ambiente. El proceso de enfriamiento dura aproximadamente 10 min. Retire los portaobjetos y enjuáguelos suavemente una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Dibuje un círculo con un rotulador alrededor del pañuelo y prepare una caja húmeda para los siguientes procedimientos.
3. Bloqueo
- Realice diluciones de trabajo mezclando 3 mL de 30% H2O2 con 27 mL de agua purificada con ósmosis inversa.
- Deje caer dos o tres gotas de solución de H2O2 al 3% gota a gota sobre el tejido para bloquear las peroxidasas. Agregue la solución H2O2 rápidamente para asegurarse de que no se desborde del círculo. Bloquear las peroxidasas en una incubadora a 37 °C durante 20 min.
- Enjuague los portaobjetos suavemente con PBS (tres lavados, 5 min cada uno).
- Bloquee los portaobjetos durante 20 min a 37 °C con albúmina sérica bovina al 5% (BSA, preparada mezclando 1,5 g de polvo de BSA con 30 mL de agua purificada con ósmosis inversa).
NOTA: El bloqueo con peróxido de hidrógeno al 3% puede prevenir el 95% de las tinciones inespecíficas y el bloqueo con BSA al 5% puede prevenir el otro 5% de las tinciones inespecíficas. Combine los dos métodos para obtener un resultado confiable.
4. Reacción antígeno-anticuerpo
- Retire el BSA al 5% y agregue 50 μL de anticuerpo primario (calretinina, S100 o PGP9.5) al portaobjetos. Incubar durante la noche a 4 °C.
- Lave el portaobjetos con PBS (tres veces, 3 minutos cada una).
- Añadir 50 μL de potenciador polimérico (reactivo A; ver tabla de materiales) a la sección e incubarla durante 20 min en una incubadora a 37 °C. A continuación, lave el portaobjetos con PBS (tres veces, 3 minutos cada una).
- Añadir 50 μL de anticuerpo secundario B (anticuerpo secundario IgG anti-conejo/ratón) a la sección e incubar durante 30 min en una incubadora a 37 °C. Lave la sección con PBS (tres veces, 5 minutos cada una).
5. Tinción de 3,3-diaminobenzidina y hematoxilina
- Añada 850 μL de agua purificada con ósmosis inversa a un tubo de 1,5 mL y añada los reactivos de tinción (véase la Tabla de materiales) en el orden A, B y C. Añada 50 μL de cada reactivo para obtener un total de 1 mL de solución de trabajo de 3,3-diaminobenzidina (DAB). Si hay precipitados, use la solución después de la filtración.
- Agregue una gota de solución de trabajo de DAB a la sección de tejido y tiña durante 3-10 min. Incube los portaobjetos en DAB a temperatura ambiente hasta que se detecte una tinción marrón. Monitoree cuidadosamente con un microscopio de campo claro. Mantenga la solución de trabajo DAB alejada de la luz. A continuación, lave el portaobjetos con PBS durante 5 min.
- Agregue una gota de hematoxilina para contratinción de los núcleos durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, sujeta el tarro de coplin y lávalo con un hilo de agua durante unos 30-40 s hasta que se elimine el exceso de tinte. Tenga cuidado de no dañar las secciones de tejido.
- Sumerja las diapositivas RSB en un frasco de coplin que contenga PBS durante 25-30 s. Luego, diferencie en ácido clorhídrico-etanol al 1% durante 10 s. Lave los portaobjetos con PBS durante 1 min.
- Deshidrate los portaobjetos en orden inverso a la hidratación: 75%, 80%, 95% y etanol absoluto (5 min cada uno).
- Exponga los portaobjetos al xileno (2 cambios, 5 min cada uno).
- Monte el cubreobjetos utilizando un montaje ultralimpio. Deje que los portaobjetos se sequen antes de visualizarlos con un microscopio.