Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de soluciones de disección y líquido cefalorraquídeo artificial
- Carbogenato de agua ultrapura (que es agua filtrada con una resistividad de 18,2 MΩ·cm) con carbógeno (95% O2/5% CO2) durante 5 min utilizando difusores de burbujas de piedra difusora (aireadores para acuarios).
nota: Las piedras difusoras se pueden conectar al regulador del tanque de carbógeno a través de un tubo de silicona estándar. Si no hay piedras difusoras disponibles, selle el extremo del tubo de silicona y haga pequeños agujeros en el sello para permitir que el gas carbógeno burbujee y carboreñe la solución.
- Prepare una solución de disección disolviendo los solutos de la Tabla 1 en agua ultrapura. Agregue CaCl2 a una solución que haya sido carbengenada durante al menos 5 minutos para ayudar a que se disuelva.
nota: Alternativamente, agregue CaCl2 primero, para que pueda disolverse fácilmente en una solución insaturada. La solución, en forma líquida, debe ser de 300 a 320 mOsm/L y tener un pH de 7,4 después de ser saturada con carbógeno.
- Enfríe la solución de disección a 0 - 4 °C. Deje la solución en el refrigerador durante la noche o coloque la solución en el congelador durante 1 h y controle continuamente la temperatura.
nota: La solución de disección se puede almacenar hasta por 3 noches; Deséchelo después.
- Carbogenar la solución de disección durante 5 - 10 min antes de usar.
nota: Idealmente, la solución debe aparecer como aguanieve o estar en transición a aguanieve antes de su uso.
- Prepare el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) de roedores disolviendo los solutos de la Tabla 2 en agua ultrapura. Carbogenar la solución de ACSF mientras se encuentra en un baño de agua calentado a 35 °C hasta su uso. Agregue CaCl2 a una solución que haya sido carbengenada durante al menos 5 minutos para ayudar a que se disuelva.
nota: Alternativamente, agregue CaCl2 primero para que se disuelva más fácilmente en una solución insaturada. La solución, en forma líquida, debe ser de 290 a 320 mOsm/L y tener un pH de 7,4 después de ser saturada con carbógeno. Las soluciones deben hacerse en volúmenes de 1, 2 o 4 L, dependiendo de la duración de los experimentos. Haz 4 L para un día completo (8 h) de experimentos. El ACSF debe hacerse fresco todos los días; No lo almacene durante más de 1 día.
2. Disección de ratones para recolectar tejido cerebral
- Reúna todas las herramientas y materiales necesarios para las disecciones de animales. Configure el espacio de trabajo para prepararse para las disecciones de animales.
- Revise el tanque de carbén (95%Ø2/5%CO2) para asegurarse de que no esté vacío. Reemplace el cilindro de gas antes de los experimentos si quedan menos de 500 psi de presión.
- Calibre el vibratomo (cortador de pañuelos con cuchilla vibratoria) de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante. Ajuste la configuración del vibratomo para que tenga una amplitud de corte de 1 mm y una velocidad de corte de 0,12 mm/s.
nota: Los ajustes óptimos pueden diferir para cada cortador de cuchilla de tejido vibratorio individual; Sin embargo, en general, la amplitud debe ser alta y la velocidad de corte debe ser baja.
- Llene la cámara de incubación del corte de cerebro (es decir, el guardián del corte de cerebro) con ACSF y burbujee con carbógeno. A continuación, coloque la cámara de incubación en un baño de agua a 35 °C.
- Obtenga un ratón juvenil de ambos sexos, entre la edad de 13 días (p13) y 21 días (p21, donde p0 es la fecha de nacimiento).
- Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (55 mg/kg de peso corporal). Una vez que el ratón esté profundamente anestesiado, como lo indica la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie, use de inmediato un instrumento de guillotina aprobado por un veterinario para decapitar al ratón con un movimiento rápido.
nota: Preparar la inyección de pentobarbital sódico de acuerdo con los procedimientos recomendados por las directrices institucionales.
- Sostenga la nariz del ratón para estabilizar la cabeza decapitada y haga suavemente una incisión en la línea media comenzando entre los ojos del ratón y a lo largo de toda la longitud del cuero cabelludo para exponer el cráneo. Asegúrese de que el cráneo no esté comprimido por la presión aplicada por la navaja. Usa la esquina del filo de la navaja para aumentar la precisión del corte.
- Separa las solapas del cuero cabelludo del ratón con los dedos para exponer el cráneo. Luego, use la esquina fresca del filo de una navaja para hacer una incisión a lo largo de la línea media del cráneo; Preste mucha atención para evitar cualquier contacto con la corteza cerebral.
- Inserte pinzas de astillas en las cuencas de los ojos del ratón para estabilizar la cabeza decapitada y colóquela en una placa de Petri llena de solución de disección fría (0 a 4 °C). Asegúrese de que la cabeza esté completamente sumergida en la solución de disección.
- Use un segundo juego de pinzas de astillas para despegar suavemente el cuero cabelludo del ratón, quitar el hueso de la nariz pelándolo y quitar la parte posterior (lado caudal) del cráneo><.
nota: El hueso de la nariz de los ratones juveniles es muy blando y se rompe fácilmente.
- Use una microespátula para cortar los nervios ópticos, los nervios trigémino y la médula espinal. Luego, use la micro espátula para separar suavemente el cerebro del cráneo. Deje el cerebro completamente sumergido en la placa de Petri llena de solución de disección.
3. Preparación de cortes corticales de la corteza somatosensorial-motora
- Llene la bandeja tampón del vibratomo con ~150 mL de solución de disección fría (0 - 4 °C).
nota: Opcionalmente, mantenga la bandeja tampón en el congelador hasta que la necesite para mantener una temperatura baja durante el procedimiento de corte.
- Pegue el tejido cerebral del ratón en la etapa del vibratomo (portamuestras/bandeja) con pegamento adhesivo instantáneo. En el caso de los ratones, corte una pequeña porción caudal del cerebro (es decir, el cerebelo) para que pueda pegarse fácilmente en el portamuestras (permitiendo que el lado rostral del cerebro mire hacia el techo)
nota: Alternativamente, se pueden preparar cortes horizontales de cerebro de ratón pegando el lado dorsal del cerebro en el portamuestras (el lado ventral del cerebro debe mirar hacia el techo).
- Coloque suavemente el soporte de muestras (con tejido cerebral) en la bandeja de tampón. Asegúrese de que la porción dorsal del cerebro esté orientada hacia la hoja del vibrátomo.
nota: Es fundamental minimizar la cantidad de tiempo que el cerebro está expuesto al aire.
4. Seccionamiento y recolección de tejido cerebral
- Corta el cerebro en rodajas de 450 μm de grosor usando el vibratomo en dirección dorsal a ventral. Asegúrese de que el cerebro permanezca completamente anclado a la bandeja de muestras mientras lo corta.
- Haz el primer corte en el cerebro del ratón para extraer el bulbo olfativo. A continuación, se realizan cortes posteriores hasta observar la zona somatosensorial-motora (situada aproximadamente a medio camino entre el bulbo olfatorio y el bregma)
nota: Opcionalmente, corte el cerebro en cortes más delgados (200 μm) hasta que el cuerpo calloso aparezca en la vista coronal del cerebro, lo que indica que el área somatosensorial-motora está cerca.
- Utilice una pipeta de transferencia de diámetro ancho para recoger cortes coronales (450 μm) que contengan el área somatosensorial-motora y sumergirlos en una placa de Petri que contenga una solución de disección fría (0 - 4 °C).
- Use una hoja de afeitar nueva y corte el exceso de tejido de las rodajas. Para cortes coronales de ratones, realice un corte transversal justo debajo de la comisura neocortical (es decir, el cuerpo calloso). No corte con un movimiento de sierra; Basta con presionar la cuchilla en el pañuelo y utilizar un cepillo para detalles para separar suavemente el tejido. Asegúrese de minimizar el movimiento del corte coronal.
- Utilice una pipeta de transferencia de diámetro ancho para transferir la porción dorsal de los cortes coronales que contienen el neocórtex (capa 1 - 6) a una segunda placa de Petri llena de ACSF caliente (35 °C) durante un momento (~1 s). A continuación, transfiera rápidamente las rodajas a una cámara de incubación que contenga ACSF.
nota: El propósito de la transferencia a la placa de Petri con ACSF es minimizar la transferencia de la solución de disección a la cámara de incubación mientras se transfieren cortes de cerebro con la pipeta de diámetro ancho. Utilice los múltiples pozos de la cámara de incubación para mantener organizados los diferentes cortes de cerebro.
- Deseche el resto del cerebro y el cadáver del animal de acuerdo con las pautas institucionales.
5. Incubación y mantenimiento
- Deje las rodajas de cerebro ligeramente sumergidas en la cámara de incubación a 35 °C durante 30 min. A continuación, retire la cámara de incubación del baño de agua y deje que vuelva a temperatura ambiente (20 - 25 °C). Espere 1 h para que los cortes de cerebro se recuperen antes de realizar registros electrofisiológicos.
nota: Asegúrese de que no haya burbujas de aire que se acumulen debajo de las rebanadas de cerebro en la cámara de incubación. Las burbujas de aire son interfaces de aire que causan daño a los tejidos. Los cortes de cerebro de ratón se pueden mantener durante 6 a 8 h en una cámara de incubación bien carbengenada con ACSF.
6. Registros electrofisiológicos de la capa cortical superficial
Nota: Los eventos ictales se observan en las grabaciones de potencial de campo local (LFP) extracelular de cortes de cerebro. La LFP del corte de cerebro se puede observar y registrar con una cámara de tipo interfaz o un sistema de matriz de electrodos múltiples sumergidos (MEA).
- Use una pipeta de transferencia de diámetro ancho o un cepillo para detalles para mover un corte de cerebro a un papel de lente precortado un poco más grande que se mantiene en su lugar con una pinza dental. Transfiera el papel de la lente (sobre el que descansa el corte de cerebro) a la cámara de grabación y asegúrelo en su posición con una pantalla de arpa.
- Deje funcionar la perfusión de ACSF carbogenada tibia (35 °C) a través de la cámara de registro sobre el corte de cerebro a una velocidad de 3 mL/min (~1 goteo/s). Utilice un termómetro digital para asegurarse de que la cámara de registro esté entre 33 y 36 °C.
- Extraiga electrodos de vidrio con una impedancia de 1 a 3 MΩ de tubos de vidrio de borosilicato (con un diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un extractor. Rellene los electrodos de vidrio con ACSF (~10 μL) utilizando una jeringa Hamilton. Deseche inmediatamente el electrodo si la punta está dañada.
nota: Blanquee el alambre de plata (5 min) y solo permita que una parte mínima (es decir, la punta) del alambre de plata se sumerja en los electrodos de vidrio rellenos de ACSF para minimizar el ruido y la deriva durante las grabaciones. Retire el exceso de ACSF del electrodo de vidrio con una jeringa Hamilton si es necesario.
- Utilice un microscopio estereoscópico 20X para guiar con precisión el electrodo de vidrio de registro hacia la capa cortical superficial (2/3) utilizando manipuladores manuales. Registre / vea la actividad eléctrica del corte de cerebro en una computadora con software estándar.
nota: Los cortes de cerebro viables (de alta calidad) exhibirán un robusto potencial evocado en respuesta a los estímulos eléctricos aplicados (100 μs, 30 - 300 μA) o pulsos de luz (30 ms, 10 mW/mm2) para el tejido optogenético.
7. Inducción de actividades similares a las convulsiones
- Perfundir ACSF que contiene 100 μM de 4-aminopirimidina (4-AP) sobre el corte de cerebro. Disuelva 80 mg de 4-AP en 8,5 mL de agua para hacer una solución madre de 100 mM 4-AP. Agregue 100 μL de solución madre de 4-AP 100 mM a 100 mL de ACSF para lograr una perfusión de ACSF con 100 μM 4-AP.
nota: Alternativamente, use Zero-Mg2+ ACSF (Tabla 3), una solución modificada de ACSF que no contiene Mg2+ añadido, para perfundir el corte de cerebro. El tiempo promedio para que aparezcan los eventos ictales es de 15 min; Sin embargo, pueden pasar hasta 40 minutos para algunos cortes de cerebro.
8. Generación de convulsiones bajo demanda: una estrategia optogenética para ratones optogenéticos
- Aplique un breve pulso (30 ms) de luz azul (470 nm) (con una intensidad de salida mínima de 1 mW/mm2) para iniciar un evento ictal. Utilice un manipulador manual para colocar una fibra óptica de núcleo de 1.000 μm de diámetro (0,39 NA) directamente sobre la región de grabación.
nota: Ajuste la frecuencia de la fotoestimulación para que coincida con la tasa deseada de ocurrencia del evento ictal (es decir, 1 pulso cada 50 s). Sin embargo, no se puede exagerar demasiado la tasa intrínseca a la que ocurren los eventos ictales.
Tabla 1: Receta para la solución de disección.Estas son instrucciones para hacer volúmenes de 1 L o 2 L. MW = el peso molecular del soluto.
| # | Reactivo | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | sacarosa | Artículo 248 | Artículo 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| número arábigo | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | Dextrosa (D-glucosa) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | número arábigo | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | Fosfato de sodio monobásico monohidratado (H2NaPO4·H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
Tabla 2: Receta para el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en roedores.Estas son las instrucciones para hacer volúmenes de 2 L o 4 L. MW = el peso molecular del soluto.
| # | Reactivo | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro de sodio (NaCl) | Artículo 123 | Artículo 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| número arábigo | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dextrosa (D-glucosa) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | Fosfato sódico monobásico monohidratado (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
Tabla 3: Receta para el líquido cefalorraquídeo artificial para roedores Zero-Mg2+ (Zero-Mg2+ ACSF).Estas son las instrucciones para hacer volúmenes de 2 L o 4 L. MW = el peso molecular del soluto.
| # | Reactivo | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro de sodio (NaCl) | Artículo 123 | Artículo 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| número arábigo | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dextrosa (D-glucosa) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4·H2O) | Nominalmente gratis | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Fosfato sódico monobásico monohidratado (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |
