Establecimiento de un modelo de crisis epilépticas inducidas por pentilenetetrazol en ratones

Resumen

Fuente: Shimada, T., et al. Modelo de ratón de encendido inducido por pentilenetetrazol. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra el proceso de inducción de epilepsia en ratones usando inyecciones de pentilenetetrazol (PTZ), un antagonista del receptor GABA-A. La administración intraperitoneal repetida de PTZ reduce progresivamente el umbral de las convulsiones al inhibir la entrada de iones de cloruro, interrumpir la neurotransmisión inhibitoria y provocar hiperexcitabilidad en las neuronas que desencadenan las convulsiones. Este proceso da lugar a la ignición y el desarrollo de convulsiones espontáneas, que imitan la epilepsia crónica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de Pentilenetetrazol (PTZ)

1. Disolver 2 mg/mL de PTZ en NaCl estéril al 0,9% (p/v). Prepare PTZ el día de su uso.

2. Inyección de PTZ

1. Realice todos los experimentos entre las 9:00 a.m. y las 12:00 p.m. (mediodía).
2. Mide el peso corporal del animal.
3. Coloque al animal en una cámara de observación para que se habitúe.
4. Durante el período de habituación (3 min), calcular el volumen de solución de PTZ para la inyección en función del peso corporal del animal y la dosis de inyección previamente determinada.
   nota: Por ejemplo, cuando se utilizan 35 mg/kg de PTZ, se requieren 0,875 mg de PTZ para un ratón que pesa 25 g (35 mg/kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Por lo tanto, se deben inyectar 437,5 μL de una solución PTZ de 2 mg/mL (0,875 mg / 2 mg/mL = 0,4375 mL). La dosis de inyección de PTZ depende del genotipo y la cepa del ratón. Para los ratones C57BL/6 de tipo salvaje, se recomienda una dosis de 30-35 mg de PTZ/kg de peso corporal para el primer ensayo. La sensibilidad a PTZ depende de la cepa de ratón utilizada. La dosis de inyección varía según el propósito del experimento.
5. Inyecte PTZ por vía intraperitoneal con una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de calibre 27 en el cuadrante izquierdo o derecho del abdomen del animal. Evite inyectarse en la línea media.
   1. Evite las inyecciones repetidas en la misma posición.
6. Observe los comportamientos de los animales durante 30 minutos después de la administración de PTZ (Figura 1A) y clasifique y califique el comportamiento anormal como se muestra a continuación. Si es posible, mantenga a los animales en observación durante 24 horas, o al menos 6-10 horas adicionales después de la inyección, especialmente una vez que la puntuación de gravedad de las convulsiones alcance 3 o más.
   1. Observe cualquier convulsión leve o cambio de comportamiento en los animales más allá del período de observación de 30 minutos. Este período prolongado de observación puede abordar un efecto particularmente importante y completo de una dosis subconvulsiva de PTZ en la generación de convulsiones crónicas no provocadas en la epilepsia.
   2. Además, mida la duración de la convulsión de cada convulsión observada a medida que los cambios en la duración de la convulsión se relacionan con la gravedad de la convulsión. Además, la latencia hasta la primera convulsión después de la inyección de PTZ es otra medida importante a recopilar. El control de la frecuencia, la duración y la latencia de las convulsiones es fundamental para cualquier estudio molecular posterior a las convulsiones.
7. Inyecte PTZ cada dos días (Figura 1A). El número de inyecciones depende del objetivo del experimento. A continuación se presentan ejemplos representativos.
   1. Para generar animales completamente encendidos, una vez que un animal experimenta una convulsión con una puntuación de 5 (convulsión tónico-clónica), finalice la inyección dentro de tres administraciones adicionales. En este caso, aumente la dosis de inyección si la puntuación de las convulsiones no aumenta durante tres administraciones consecutivas. Cada animal puede recibir un número y una dosis diferentes de inyecciones de PTZ.
   2. Fijar el número y la dosis de inyección de PTZ en todas las condiciones para evaluar la vulnerabilidad a PTZ, incluidas las evaluaciones de medicamentos contra la epilepsia y los estudios del fenotipo de ratones modificados genéticamente. Administre a todos los animales el mismo número de inyecciones de PTZ; Se recomienda un total de 8 a 12 inyecciones. Si un animal muere, la puntuación de convulsiones debe denotarse como 6.
   3. Determinar la dosis inyectable necesaria para mantener una puntuación alta de convulsiones (4 o 5) durante 10 o más inyecciones para estudiar los cambios histopatológicos que ocurren en las convulsiones epilépticas. En este caso, el número total de inyecciones debe oscilar entre 25 y 30. Disminuya la dosis de inyección si la puntuación de convulsiones llega a 5. Si la puntuación de las convulsiones disminuye a 3 o menos, aumente la dosis de la inyección.

Resultados

Figura 1: Breve descripción del protocolo. (A) Ilustración esquemática de la leña mediada por PTZ. (B) Ilustraciones de comportamientos animales representativos para las respectivas puntuaciones de convulsiones.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pentilenetetrazol	Sigma-Aldrich	P6500
Cloruro de sodio	MANAC	7647-14-5
ratón	CLEA Japón		C57Bl/6NJcl, postnatal de 8 semanas, hombre
Jeringa (1mL)	Terumo	SS-01T
Aguja (27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Báscula	Mettler	PE2000	Este artículo es un producto descontinuado. Casi equivalente a FX-2000i con FXi-12-JA de la compañía A&D.