Inducción de isquemia a través de la oclusión de la arteria carótida común y cerebral media en un modelo de rata

Resumen

Fuente: Wayman, C. et al., Realización de una oclusión permanente del cerebro medio distal con la arteria carótida común en ratas envejecidas para estudiar la isquemia cortical con discapacidad sostenida. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra el procedimiento de realizar una oclusión permanente de la arteria cerebral media distal, o MCAO, con la arteria carótida común, o ligadura de CCA, en ratas envejecidas para modelar un accidente cerebrovascular isquémico. Esto bloquea el flujo sanguíneo al cerebro, lo que conduce a la muerte neuronal y genera un modelo para estudiar los mecanismos del accidente cerebrovascular y los posibles tratamientos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Cirugía

1. A los 16-18 meses (250 a 400 g) se utilizaron ratas hembras ancianas Lister-Hooded e inducir la anestesia con isoflurano al 5% en 1,5 L/min O₂. Después de la inducción de la anestesia, reducir el nivel de isoflurano y mantenerlo a una profundidad adecuada pero minimizada para la cirugía (e.g., 1,5-2%). Administre la anestesia al animal mediante una mascarilla y utilice un sistema de eliminación para limitar la exposición del cirujano al isoflurano.
   1. Realizar todos los procedimientos hasta, pero sin incluir la craneotomía en animales simulados, ya que este procedimiento puede producir déficits de comportamiento. Tenga en cuenta los objetivos experimentales al diseñar experimentos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO, por sus siglas en inglés) y decida si se debe incluir o no un grupo simulado para controlar la craneotomía.
2. Administrar analgésicos pre o perioperatorios (Carprieve, 0,25 mg/kg, s. corte).
   1. Añadir 1 ml a 19 ml de solución salina estéril al 0,9% para hacer la solución madre e inyectar 0,6 ml por rata de 300 g. Se prefiere el uso de Carprieve sobre el Carprofeno porque el primero es estable a temperatura ambiente (RT).
3. Afeita el pelaje en la región ventral del cuello y la región temporal en el hemisferio derecho para exponer la piel. Desinfecte los sitios quirúrgicos con hisopos de etanol.
   1. Realice este paso lejos del área de operación para minimizar la cantidad de pelo en el sitio de la incisión.
4. Coloque la rata en un tablero de corcho cubierto con una cortina estéril en posición supina sobre una almohadilla térmica. Aplique la crema de lidocaína en las regiones afeitadas de la cabeza y el cuello. Inserte una sonda rectal para controlar y mantener la temperatura del animal entre 36,5 y 37,5 °C con un sistema homeotérmico.
   1. Aplique ungüento de lacrimuelo en los ojos para evitar que se sequen. Administre a la rata una inyección de solución de sulfato de atropina (0,05 ml de una solución de 600 μg/ml, por vía subcutánea) para reducir las secreciones traqueales.
      NOTA: Los investigadores deben considerar la medición de variables fisiológicas como los gases en sangre y la presión.
5. Antes de comenzar la cirugía, verifique la retirada del pellizco de la pata trasera y los reflejos de parpadeo para confirmar la anestesia completa.
6. Bajo un microscopio de disección, haga una incisión de 2 cm en la línea media central del cuello expuesto con un bisturí. Mueva las glándulas salivales suavemente hacia el lateral de la tráquea en ambos lados.
7. Enrolle una sutura de seda no absorbible alrededor de la piel que recubre la arteria carótida común en un lado. Retire suavemente la piel del sitio con la sutura de seda y péguela a la tabla de corcho con cinta quirúrgica para revelar la arteria carótida común. Diseccione cuidadosamente las arterias libres de la fascia circundante y los nervios vagos con pinzas finas.
   1. Tenga cuidado de no dañar el músculo o los nervios vagos durante este paso, ya que esto afectará la alimentación, la deglución y la respiración.
8. Una vez expuesta la arteria carótida común, se utiliza una sutura de seda no absorbible (5/0) para aislar la carótida, separando primero la carótida del nervio vago mediante disección inversa con pinzas finas y teniendo cuidado de no entrar en contacto con el nervio. Una vez que el vaso se haya enrollado (pero no atado) con la sutura, pegue los extremos de la sutura con cinta quirúrgica para evitar que este paso se deshaga. Retire las suturas que sujetan la piel suprayacente.
9. Repita para el otro lado.
10. Coloque una gasa estéril empapada en solución salina en la herida para mantener los tejidos húmedos durante el resto de la cirugía. Sutura la piel sin apretar y coloca una gasa adicional empapada en solución salina sobre el área para evitar una mayor deshidratación.
11. Coloque las ratas en posición lateral y haga una incisión en la piel en el punto medio entre la órbita derecha y el canal auditivo externo. Retraiga la piel con hasta cinco retractores de gancho elásticos de 3 mm fijados a la tabla de corcho y luego diseccione el músculo temporal para revelar el cráneo.
12. Coloque un goteo de solución salina impulsado por gravedad ajustado por la rueda del pulgar sobre el sitio abierto (caudal de aproximadamente 2 ml/min) y configure un sistema de aspiración para eliminar los restos óseos y eliminar el sangrado menor del sitio expuesto durante esta fase de la cirugía.
    1. Coloque la boquilla de suministro de solución salina en el punto más alto del cráneo, cerca de la oreja, y la boquilla del aspirador en el punto más bajo. Ajuste la rueda durante las hemorragias para suministrar más solución salina a la zona y visualizar mejor el origen de cualquier hemorragia para la cauterización del vaso, reduciendo la cantidad de tiempo que los animales están bajo anestesia.
13. Realice una craneotomía en la región expuesta (aproximadamente 5 mm x 5 mm) utilizando un taladro dental con una fresa gruesa recubierta de diamante de 1,6 mm a aproximadamente 8.000 rpm, asegurando la aplicación de presión circular y lateral y no presión hacia abajo mientras se perfora el área expuesta. Una vez que el hueso sea lo suficientemente delgado como para verse completamente transparente, retírelo con pinzas.
14. Utilice un gancho dural casero, hecho doblando una punta de pinza fina aproximadamente 180° para formar un arco, para abrir cuidadosamente la duramadre, teniendo cuidado de evitar los vasos sanguíneos de gran superficie, ya que son delicados y fáciles de romper.
    NOTA: El área expuesta del cerebro revelará la arteria cerebral media (ACM); el segmento deseado mide aproximadamente 2 mm de longitud (ver Figura 1).
15. Coagular el ACM desde donde cruza la vena cerebral inferior, hasta el punto de bifurcación de la arteria y luego a lo largo de las ramas caudales del ACM usando un par de pinzas de diatermia hasta que esté completamente ocluido. Utilice pinzas diatérmicas Jeweler en ángulo con puntas puntiagudas de 0,25 mm.
    1. Al ocluir la arteria, altere el flujo salino según sea necesario para mantener esta área fresca, evitando que las pinzas coagulantes se adhieran al vaso sanguíneo. Cuando se ocluye, el vaso sanguíneo aparece negro y no debe haber signos de flujo sanguíneo; El flujo sanguíneo se puede ver en vasos parcialmente ocluidos.
    2. Corte el MCA en este punto para confirmar la oclusión completa. Con unas tijeras microvasculares, corte por debajo de donde la vena cerebral inferior cruza el MCA.
    3. Cubra el área expuesta con una gasa empapada en solución salina antes de continuar con el siguiente paso.
16. Vuelva a colocar a la rata en posición supina y vuelva a abrir la sutura atada sin apretar en el cuello para volver a exponer las arterias carótidas. Ligue la arteria carótida del mismo lado que la ACM ocluida (derecha) de forma permanente haciendo un nudo en la sutura de seda alrededor de la carótida, mientras que la arteria carótida izquierda se ocluye transitoriamente con una pinza arterial de acero inoxidable de 13 mm con una presión de 125 g durante 60 min. Sutura sin apretar la incisión en el cuello durante este tiempo y coloca una gasa estéril empapada en solución salina encima para evitar la deshidratación.
    1. Tenga en cuenta que el lado derecho del animal estará en el lado izquierdo del cirujano, dada la posición supina.

Resultados

Figura 1. Configuración quirúrgica del modelo de oclusión permanente de la arteria cerebral media distal. El equipo utilizado en la configuración de la craneotomía en ratas se muestra para el hemisferio derecho, y el recuadro, la posición del aspirador y el goteo de solución salina alrededor del sitio de la craneectomía. También se muestran las características clave de la vasculatura; Se muestran la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Carprofeno	Norbrook	Nº de VM; 02000/4229	da 0,25 mg/kg
Sulfato de atropina	AmTech	RXATRINJ-100
Hisopos con alcohol	UHS	20021
Crema de lidocaína (Emla)	AstraZeneca	12901	Aplique una gota del tamaño de un guisante en el cuello afeitado y las regiones temporales
Sistema de mantas homeotérmicas	Instrumentos de Harvard	507222F
Pinzas	Herramientas de Bellas Ciencias	11019-12
Isoflurano	Abbott	B506
Suturas de seda	Aparato de Harvard	723288
Sistema de cauterización	Eschmann
0.25 mm Pinza de caurterio de joyero	Eschmann	8330349
pinza de Dumont fina	Herramientas de Bellas Ciencias	11251-10
Sistema de goteo salino accionado por pulgar
Sistema de aspiración Vacusafe	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
Fresas de acero gruesas recubiertas de diamante de 16 mm		K801 104 016
Taladro dental de mano	NSK	NSKVMAXVRE (Pieza de mano NSKEX6B)
Tijeras de resorte Vannas	Herramientas de Bellas Ciencias	15000-03
Tijeras microvasculares	Instrumentos de precisión mundiales	501790
4-0 Suturas Vicryl	Ethicon
Pinza vascular y aplicador
Microscopio de operación	Zeiss
Sistema de anestesia compacto Isoflurano K/F Monogas	Soluciones VetTech
Hojas de bisturí de acero al carbono n.º 10	Swann-Morton	201
Agujas de 25 g	Terumo	NN-2525R
Jeringas (1 ml y 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
solución salina (cloruro de sodio 0,9%)	Fresenius Kabi	Pl 08828/0178
Bastoncillos de algodón	Johnson y Johnson	5.00021E+12	esterilizar antes de usar
Gasa			esterilizar antes de usar