Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Prepare la jeringa para la inyección
- Disolver la lisolecitina en una solución al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) y almacenar a -20 °C en pequeñas alícuotas (75 μl). Descongele un vial a temperatura ambiente (RT).
nota: Si la lisolecitina no está disuelta, sonicar el tubo en un limpiador ultrasónico (40 kHz) durante aproximadamente 30 minutos para formar una solución uniforme.
- Manipule el capilar de vidrio preestirado con extremo cuidado para evitar dañar la delicada punta. Desenrosque la tuerca de una jeringa inyectora de 10 μl y enrósquela en el extremo plano del capilar, seguido de dos férulas, asegurándose de que los extremos de acoplamiento de las férulas se alineen y que el capilar esté ajustado en la férula cónica (Figura 1). Enjuague la jeringa con alcohol isopropílico y retire el émbolo. Una vez seco, atornille el conjunto de la aguja con la mano en la jeringa inyectora.
- Fije la aguja de cubo de metal a la jeringa de cebado. Perfora un disco de goma con la aguja y deslízalo hasta la base. Llene la jeringa de cebado con lisolecitina. Presione suavemente la jeringa de cebado hasta que se vea líquido en la punta de la aguja. Esto asegura que no se introduzcan burbujas de aire en la jeringa de inyección.
- Inserte la aguja de cubo de metal de la jeringa de cebado en la jeringa de inyección. Haciendo un sello firme con el disco de goma, presione lentamente la jeringa de cebado hasta que el capilar llene la punta con solución. Retire con cuidado la jeringa de cebado mientras presiona simultáneamente para llenar el cilindro de la jeringa de inyección sin introducir burbujas de aire. Inserte el émbolo en la jeringa de inyección y asegúrese de que la solución fluya desde la punta del capilar mientras el émbolo se presiona suave>nota: Si hay burbujas de aire visibles en el capilar o en la jeringa de inyección, se debe repetir la preparación de la jeringa desde el principio. El fluido continuo en el aparato de inyección es fundamental para garantizar volúmenes de inyección precisos.
- Conecte la jeringa inyectable completa al brazo de un micromanipulador estereotáctico. Este aparato completo será capaz de inyectar a 15-20 animales antes de necesitar ser rellenado.
- Deseche la lisolecitina restante de la jeringa de cebado. Retire y deprima el alcohol isopropílico varias veces y separe la aguja del cubo de metal. Espere varias horas a que se evapore el alcohol isopropílico restante en la jeringa de cebado antes de volver a llenar.
2. Preparar al animal para el procedimiento quirúrgico
NOTA: Este procedimiento está descrito para ratones hembra C57BL/6 de 8 a 10 semanas de edad.
- Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de ketamina (200 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) o según las normas institucionales de cuidado animal. Planifique que el animal esté bajo anestesia durante aproximadamente 1 hora si usa anestesia inyectable.
- Pruebe que el animal esté profundamente anestesiado pellizcando firmemente la pata. Un animal debidamente anestesiado no responderá al pellizco.
- Con una maquinilla, afeite un área de 2-3cm2 en el lado dorsal del animal, cerca de las orejas. Tenga cuidado de no dañar los oídos.
- Limpie el área con etanol al 70% aplicado a una gasa. Asegúrese de que todo el vello recortado se haya eliminado del área. Desinfecte el área con yodo.
- Aplique vaselina en los ojos para evitar que se seque durante todo el procedimiento.
- Mantenga al animal en una cámara de recuperación climatizada hasta que esté listo para comenzar el procedimiento.
3. Realizar el procedimiento quirúrgico
NOTA: Asegure una técnica aséptica adecuada para todos los pasos del procedimiento. Esto incluye el uso adecuado de guantes, redecillas para el cabello, mascarillas y cortinas. Todas las herramientas deben estar esterilizadas antes de entrar en contacto con el animal.
- Mueva al animal a un marco estereotáctico, con el lado dorsal hacia arriba, elevado en la sección media por toallas de papel dobladas para exagerar la curvatura de la columna vertebral. Sujete los brazos y la cola con cinta quirúrgica y asegure la cabeza con una pinza para dientes. Las barras estabilizadoras para los oídos no son necesarias para este procedimiento.
- Use un bisturí para hacer una incisión de 3 cm en la línea media, comenzando justo debajo de las orejas y cortando en la dirección caudal.
- Localice la división entre las dos estructuras adiposas grandes y use pinzas finas en cada mano para separarlas. Extienda los retractores para abrir el campo quirúrgico.
- Bajo un microscopio quirúrgico, localice el proceso de excrecencia prominente de la vértebra torácica 2 (T2) (NOTA: Esta característica es característica de la cepa de ratón C57BL/6). Realice una disección roma con tijeras de resorte cerradas a través de la musculatura superpuesta para visualizar mejor T2. Con las pinzas, palpa las superficies duras de la vértebra torácica 3 (T3) y la vértebra torácica 4 (T4) para confirmar la ubicación anatómica adecuada.
- Con unas tijeras de resorte, haga cortes laterales poco profundos (2-3 mm de profundidad) del tejido conectivo entre T3 y T4. Debido al espacio natural entre las vértebras en la porción torácica superior de la columna vertebral del ratón, no es necesario realizar una laminectomía para revelar la médula espinal. Tenga en cuenta que un corte demasiado profundo perforará y dañará el cordón.
nota: Un pequeño grado de sangrado es común durante este paso. Si esto ocurre, sostenga una lanza de esponja en el área hasta que el sangrado disminuya (30-60 segundos).
- Visualiza la médula espinal. Se cubrirá con una capa gruesa de duramadre visible si esta capa meníngea aún no se ha cortado al exponer el cordón. Un vaso sanguíneo prominente corre caudal/rostral a través de la línea media aproximada de la médula espinal.
nota: Esta vasculatura no debe utilizarse como punto de referencia para la línea media. En cambio, una iluminación adecuada debe revelar los límites de materia gris-blanca que flanquean la columna dorsal, que deben usarse para estimar la línea media.
- Si la duramadre permanece intacta, haga raspados laterales suaves con una aguja de metal de 32 G hasta que se elimine. El objetivo es extirpar la duramadre sin cortar las meninges subyacentes restantes, que no son tan gruesas y son más difíciles de ver.
nota: La liberación de líquido cefalorraquídeo indica una ruptura de la aracnoides, y aunque esto puede ocurrir sin daño mecánico al tejido, el líquido cefalorraquídeo acumulado debe eliminarse con una lanza de esponja para visualizar mejor la superficie del cordón.
- Mueva la jeringa inyectora en su lugar y bájela lentamente hasta que la punta del capilar apenas toque la médula espinal inmediatamente lateral de cualquier lado de la línea media. Bloquee el brazo en su lugar.
- Utilice las mediciones graduadas del brazo estereotáctico de dirección Z para realizar una medición de posición de referencia. De esta lectura, reste 1,3 mm. Utilice un movimiento descendente rápido y poco profundo para perforar el tejido y baje con cuidado el capilar hasta alcanzar la nueva medición. Opcional: si se desea, las lesiones en la columna dorsal pueden producirse por el mismo movimiento de perforación en la línea media y una profundidad de 0,3 mm.
nota: Estos valores son específicos para inyectar entre T3 y T4. Si opta por realizar la inyección en cualquier otro lugar de la médula espinal, estos valores deben derivarse de cualquier atlas de cerebro de ratón disponible.
- Utilice el micromanipulador para deprimir la lisolecitina en la sustancia blanca de la médula espinal ventral. Realice una rotación del micromanipulador cada 5 segundos durante 2 minutos, lo que da como resultado un volumen final de 0,5 μl. Deje el capilar en su lugar durante 2 minutos más para evitar el reflujo de la solución y luego retire con cuidado el capilar.
- Ata una sola sutura en el músculo/tejido adiposo que recubre la columna vertebral. Utilice una sutura ininterrumpida para cerrar la piel. Aplique más yodo en el sitio de la incisión.
- Coloque al animal en una cámara de recuperación calentada hasta que se recupere, luego devuélvalo a su jaula. Aplicar analgésicos en el postoperatorio de acuerdo con la normativa institucional de cuidado animal. Por lo general, no son necesarios cuidados postoperatorios adicionales, ya que los animales son completamente ambulatorios y capaces de alimentarse y beber por sí mismos tan pronto como se recuperan de la anestesia.
- Repita el procedimiento para los animales restantes.
nota: Con competencia, la operación se puede completar en 10-15 minutos por animal, especialmente con la ayuda de una segunda persona que ate las suturas. El mismo capilar de vidrio se puede usar durante aproximadamente 15-20 cirugías antes de que la punta se rompa y deba reemplazarse. Las cirugías de control se pueden realizar de manera idéntica a la descrita, con una inyección de PBS en la médula espinal en lugar de lisolecitina. No recomendamos limpiar los capilares para su uso futuro.
