1. Preparación de medios y reactivos
- Descongele el recubrimiento de la matriz de la membrana basal para las placas de cultivo a 4 °C (no permita que la matriz de la membrana basal se caliente o se solidificará). Prepare alícuotas de 1 mL y guárdelas a -20 °C o -70 °C.
- Reconstituya el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) a 10 μg/mL y haga alícuotas de 10 μL. Guárdelos a 4 °C.
- A un frasco nuevo de 500 ml de DMEM/F12 con glutamina sin abrir, agregue B27 (10 ml), N2 (5 ml) y penicilina-estreptomicina (5 ml). Coloque 50 ml de este medio de células madre neurales (NSC) en un tubo cónico y agregue 10 μl de 10 μg/μl (2 μg/ml final) de bFGF. Almacene el soporte NSC (+) bFGF a 4 °C.
- Para hacer (-) medios bFGF, use la misma receta que se describe en el paso 1.3 pero no agregue bFGF. Este medio se utilizará para diferenciar las NSC a las neuronas y para mantener los cultivos neuronales después de la diferenciación.
2. Construcciones lentivirales
NOTA: Antes de comenzar a trabajar con construcciones lentivirales, asegúrese de que el laboratorio haya sido aprobado para usar agentes de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Además, se deben utilizar capuchas de cultivo BSL-2, equipos de protección personal (EPP) y métodos de eliminación cuando se trabaja con vectores lentivirales.
- Obtenga construcciones tau empaquetadas en lentivirus de una fuente preferida.
3. Cultivo de células madre neurales humanas
NOTA: Las NSC se siembran típicamente a 100,000–150,000 células/cm2 y la mayoría de las NSC disponibles comercialmente se venden como 1 x 106 células/vial. Este protocolo se ha optimizado para placas de cultivo celular de 10 cm (aunque se pueden utilizar otros tamaños de placas); por lo tanto, si se utilizan NSC disponibles comercialmente, es posible que sea necesario expandirlas cultivándolas primero en placas de seis pocillos para obtener suficientes células para sembrar placas de 10 cm. Este protocolo se puede adaptar alternativamente a una variedad de tamaños de placas de cultivo celular.
- Para la preparación de placas de cultivo celular, retire una alícuota de recubrimiento de matriz de membrana basal congelada para placas de cultivo celular y deje que se descongele a 4 °C (las alícuotas se pueden colocar a 4 °C durante la noche el día antes de que se siembren las células). Agregue 385 μL de recubrimiento de matriz de membrana basal a 5 mL de medio DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina.
NOTA: 5 mL de medio DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina es suficiente para cubrir una sola placa de 10 cm (1 mL de esta solución de recubrimiento de matriz de membrana basal es suficiente para cubrir un pocillo de una placa de seis pocillos). Alternativamente, si las células se van a fijar e inmunoteñir, o teñir para tioflavina, cultive células en cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de 24 pocillos.
- Mantenga fríos los medios y el recubrimiento de la matriz antes y durante su adición a las placas de cultivo. Añada el recubrimiento de la matriz de membrana basal a las placas de cultivo y colóquelas en una incubadora (a 37 °C) durante 1 h. Para un recubrimiento óptimo, no incube la matriz de la membrana basal durante más o menos de 1 h. Después de 1 h, aspire el recubrimiento de la matriz de la membrana basal de las placas de cultivos celulares. Asegúrese de que esto coincida con que los NSC estén listos para ser chapados.
nota: Si las células no se descongelan de las existencias congeladas, omita el paso 3.2 y continúe con el paso 3.3.
- Si se van a descongelar células de existencias congeladas de NSC, tome un vial de células congeladas y caliéntelo en un baño de agua calentado a 37 °C moviendo el vial hacia adelante y hacia atrás en el agua. Una vez descongelado, rocíe el vial con etanol al 70% y colóquelo en una campana de cultivo celular. Transfiera las células a ~ 10 mL de DMEM / F12 + penicilina-estreptomicina y centrifugue el tubo a temperatura ambiente a 1,000 x g durante 5 minutos. Aspire el medio y vuelva a suspender las células en el medio NSC.
- Diluya las células en medios NSC para obtener la densidad de siembra adecuada para el recipiente de cultivo celular que se está utilizando.
nota: Por ejemplo, si las NSC se siembran en una placa de seis pocillos (un pocillo en una placa de cultivo de seis pocillos tiene una superficie de 9cm2), se requieren de 900.000 a 1.350.000 células para sembrar. Por lo tanto, un vial que contiene 1.000.000 de células puede resuspenderse en 2 ml de medio y añadirse a un solo pocillo de una placa de seis pocillos.
- Agregue suficientes células suspendidas en el medio NSC para sembrar las placas de cultivo recubiertas de matriz de membrana basal (100.000 células/cm2) y cambie el medio cada dos días (si utiliza un caldo congelado, cambie el medio el día después de la siembra y cada dos días a partir de entonces). Haga crecer las células hasta que tengan un 75%-80% de confluentes.
nota: Es probable que las células alcancen una confluencia del 75%-80% poco después de la siembra, pero esto puede llevar más tiempo si se utilizan existencias congeladas.
- Una vez que las NSC tengan una confluente del 75 % al 80 %, comience la diferenciación neuronal eliminando el medio NSC (+) bFGF y reemplazándolo con el medio NSC (-) bFGF. Cultive las células en este medio (reemplazando el medio cada dos días) durante al menos 4 semanas.
nota: Las células continuarán dividiéndose durante unos días tras la retirada de bFGF; Por lo tanto, las células pueden alcanzar una confluencia del 90-100%.
- Después de cultivar durante 4 semanas, las células habrán alcanzado un destino neuronal y estarán listas para el tratamiento del lentivirus.
4. Transducción y mantenimiento de cultivos neuronales
- Para transducir neuronas con lentivirus, utilice un recuento de títulos de 3,4 x 105 unidades transducibles por célula (una placa de 10 cm 100% confluente contendrá ~10 millones de neuronas). Diluya las unidades transducibles a la concentración necesaria en los medios de cultivo celular y añádalas a las células (utilice el volumen normal de medios para la placa de cultivo celular). Dos días después de añadir el lentivirus, lave las células 1 vez con medios frescos (-) bFGF (sin lentivirus) y continúe cultivando en medios (-) bFGF como de costumbre.
- Para el tratamiento post-lentiviral, alimente las neuronas transducidas cambiando el medio de cultivo celular ([-] bFGF) cada dos días. Mantenga las células durante ~ 8 semanas después de la transducción. Visualice rutinariamente las células bajo un microscopio óptico para garantizar su viabilidad.
nota: La escasez o las roturas dendríticas son signos de que las células ya no son viables.
