Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparativos
- Modificar un catéter venoso periférico de 16 G para la intubación. Para modificar, acorte la aguja 1 cm y doble la distal restante 1 cm 30° hacia la válvula de inyección. Retire las alas del catéter (uso múltiple).
- Para hacer una sonda de presión intracraneal o PIC, corte un trozo de tubo de polietileno de 20 mm (diámetro interior (ID): 0,58 mm, diámetro exterior (OD): 0,96 mm) y queme un extremo para hacer una placa circular, manteniendo un lumen abierto. Evite el tubo de polietileno con 1 mm de tubo de silicona (ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm) antes de conectar 10 mm de tubo de silicona (ID: 0,76 mm, OD: 2,4 mm) al extremo del tubo de polietileno.
- Encienda la computadora portátil y abra el software de adquisición de datos. Calibre los transductores de presión arterial (PA) e intracerebral (PIC) y el Laser-Doppler de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Prepare el aparato analizador de gases en sangre.
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que haya suficiente isoflurano en el vaporizador.
- Encienda el O2 y el flujo de aire atmosférico. Establece el flujo de O2 al 30% y el aire atmosférico al 70%.
- Coloque la almohadilla térmica y ajuste la temperatura a 37 °C.
2. Anestesia
- Coloque la rata en la cámara de anestesia con un flujo de 30% de O2 y 70% de aire atmosférico. Administrar un 5% de gas isoflurano en la cámara. La anestesia adecuada tomará alrededor de 4 minutos. Controle la respiración cuidadosamente.
- Cuando esté anestesiada, coloque a la rata en posición supina sobre una placa pesada rodeada por una banda elástica. Coloca los dientes delanteros de la rata debajo de la banda elástica.
- Saca la lengua con cuidado con pinzas curvas. Limpie la laringe con una punta de algodón. Coloca una luz externa en la línea media de la garganta para visualizar las cuerdas vocales.
- Intuble durante la inspiración con el catéter de vena periférica modificado de 16 G. Cuando esté correctamente insertado, retire el estilete. Conecte el catéter al ventilador.
NOTA: La colocación correcta del tubo se confirma mediante movimientos torácicos sincronizados con la frecuencia respiratoria. Si se observan movimientos del abdomen, extubar y volver a introducir la rata en la campana de anestesia. No repita el procedimiento más de tres veces debido al riesgo de dañar las vías respiratorias.
- Cuando esté intubado, mantenga al animal en respiración artificial con 30% de O2 y 70% de aire atmosférico. Mantener la anestesia al 1,5%-3% de isoflurano. Ajuste el isoflurano para mantener la presión arterial entre 80-100 mmHg.
- Mantenga el volumen inspiratorio del respirador en 3 mL y la frecuencia en 40-45 inspiraciones/min. Ajustar el volumen inspiratorio de acuerdo con la gasometría.
- Haz un punto a través del tejido blando interno de la mejilla con una sutura 2-0. Ate la sutura alrededor del tubo de inyección y la válvula de inyección del catéter de la vena periférica para sujetar el catéter.
- Mueva la rata al campo quirúrgico y colóquela en posición supina con la cola mirando hacia el cirujano.
- Aplique el gel para ojos cuando sea necesario para contrarrestar la sequedad ocular.
- Realice un pellizco en el dedo del pie para confirmar una profundidad adecuada de anestesia. Evaluar y mantener la profundidad de la anestesia durante la cirugía.
3. Catéter de cola
- Desinfectar los 3-4 cm proximales de la cola con etanol de clorhexidina al 0,5%.
NOTA: A partir de ahora, utilice el microscopio quirúrgico a discreción del cirujano.
- Hacer una incisión cutánea de 15-20 mm en el extremo proximal de la cola en el lado ventral. Tenga cuidado de no incidir la arteria.
- Afloje la piel del tejido conectivo subyacente con una pinza curva.
- Penetre con cuidado la fascia exponiendo la arteria.
- Libere con cuidado la arteria de la cola del tejido subyacente con una pinza curva.
- Desliza tres hilos de seda negra debajo del recipiente. Coloque un hilo lo más distalmente posible y haga un nudo quirúrgico firmemente alrededor de la arteria. Sostenga los extremos sueltos del hilo con un hemostático.
- Ata los dos hilos restantes sin apretar alrededor de la arteria.
- Empuje el hilo proximal lo más proximalmente posible. Aplique un hemostático para sujetar los extremos del hilo proximal. Tire del hemostático ligeramente, pero lo suficiente como para restringir y bloquear el flujo sanguíneo. Coloque el hemostático en el abdomen.
- Corte la punta del catéter en un ángulo de 45°. Corte la punta afilada para evitar la penetración de la pared arterial.
- Con una tijera Vannas, haga una incisión en la arteria de 1/3 del diámetro de la arteria en un ángulo de 30°, a 3-5 mm del nudo distal.
- Inserte el catéter en la arteria con dos pinzas rectas. Use una pinza para sujetar el catéter y la otra para jalar cuidadosamente la arteria sobre el catéter.
- Inserte el catéter por el vaso hasta el nudo proximal y afloje el nudo del hemostático. Visualice el flujo sanguíneo en el catéter. Sujete la rosca del medio sin apretar al catéter.
- Continúe la inserción hasta el punto donde la arteria vuelve a estar cubierta por la fascia y, si es posible, un poco más allá.
- Controle la colocación del catéter y las posibles fugas mediante el lavado con solución salina.
- Fije los dos hilos proximales con nudos quirúrgicos.
NOTA: La medición de la presión arterial debe ser pulsátil; De lo contrario, el catéter no está colocado correctamente.
- Sujete el catéter en el extremo de la incisión haciendo un nudo quirúrgico con el hilo distal.
- Sutura la incisión cutánea sin apretar con dos suturas monofilamento 4-0 no reabsorbibles. Tenga cuidado de no penetrar el catéter.
NOTA: A lo largo de la cirugía, tenga en cuenta la amplitud de la pulsación. Si este es bajo, enjuague el catéter con solución salina.
- Afloje el catéter arterial del transductor de presión para permitir el flujo sanguíneo para la toma de muestras de gases en sangre. Coloque un tubo microcapilar en el extremo del catéter. Deje que la sangre fluya hacia el tubo. Vuelva a conectar el catéter al transductor después de la extracción de sangre y enjuague el catéter.
- Inserte el tubo capilar en el analizador de gases en sangre. Mide el pH, el pCO2 y el pO2 y anótalos
NOTA: Dependiendo de los valores de gases en sangre y presión arterial, cambie la velocidad de ventilación. Si la presión arterial media (PAM) es demasiado baja, intente reducir el caudal de isoflurano. Pruebe los reflejos para asegurarse de que la anestesia tenga la profundidad adecuada.
4. Sonda ICP
- Coloca a la rata en el marco estereotáxico. Es importante colocar la rata de forma simétrica.
- Coloque una almohada cilíndrica debajo del marco estereotáxico para crear una flexión anterior del cuello.
- Afeita el cuero cabelludo, el cuello y el área detrás de las orejas de la rata. Retira el vello superfluo.
- Desinfectar la zona con etanol de clorhexidina al 0,5%.
- Anestesiar localmente con 0,7 mL de lidocaína de 10 mg/5 μg/mL con adrenalina, insertar la aguja en el extremo caudal del cráneo en la línea media. Inyectar en la musculatura del cuello con 0,3-0,4 mL. Inyecte el resto por vía subcutánea alrededor y por delante del bregma.
- Hacer una incisión en la piel de la punción de la aguja ~8 mm caudalmente en la línea media.
- Disecciona todos los músculos sin rodeos en capas para identificar la membrana atlantooccipital (triángulo de color mármol caudalmente al cráneo en la línea media).
- Utilice el retractor Alm para sujetar la musculatura del cuello. Coloque el retractor con púas caudalmente si es necesario.
- Compruebe si la sonda ICP estéril está conectada al transductor ICP. Enjuague la sonda ICP con solución salina. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la sonda ICP.
- Incidir la membrana atlantooccipital con una aguja de 23 G. Haga un orificio para persuadir a la sonda ICP a través de la membrana.
- Lleve la sonda a través de la membrana atlantooccipital suavemente. Tire ligeramente de la sonda y asegúrese de que muestre una curva pulsante que oscile entre 0 y 5 mmHg. De lo contrario, retire la sonda, verifique la conexión al transductor y confirme el flujo a través del lumen.
- Aplica dos gotas de pegamento para tejidos. Mueva el tubo de silicona de 1 mm hacia adelante hasta la membrana y aplique pegamento adicional para minimizar el riesgo de desplazamiento de la sonda ICP.
- Retire los retractores.
- Realice una sutura horizontal de colchón hasta el extremo cefálico de la incisión y una sutura interrumpida simple hasta el extremo caudal utilizando una sutura monofilamento 4-0 no reabsorbible.
5. Colocación de la aguja y la sonda Laser-Doppler
- Haz una incisión en la línea media justo antes de los ojos, 15 mm caudalmente.
- Extirpar el tejido conectivo y los músculos con pinzas. Utilice el extremo de un hisopo de algodón estéril como un rougine que permita identificar el bregma y las suturas coronales.
- Coloque el retractor Alm.
- Coloque una aguja espinal de 25 G en el marco estereotáxico. Coloque la aguja exactamente en el bregma y observe la posición.
NOTA: Coloque la articulación de la línea media del marco estereotáxico a 30° hacia el animal en el plano vertical.
- Retire la aguja de la brema , mueva el marco 65 mm hacia delante y luego vuelva a colocar la aguja en la línea media para marcar el sitio de perforación.
- Taladre hasta que se identifique la duramadre debajo del hueso. Retire suavemente los fragmentos de hueso con pinzas rectas y llene la cavidad con cera ósea.
- Taladre otro orificio de 3-4 mm lateral a la derecha del bregma y justo antes de la sutura coronal para el Laser-Doppler. No es necesario perforar todo el camino a través del hueso. Tenga cuidado de no penetrar en la duramadre.
- Busque los vasos donde el láser-doppler puede medir el flujo sanguíneo. Coloque el láser doppler y compruebe los valores. Se requiere un valor mínimo de 100 FU. Retire el microscopio (luz artificial).
- Si los valores siguen siendo aceptables, añada una gota de pegamento para fijar la sonda.
- Vuelva a comprobar para confirmar si el valor está por encima de 80 FU. Si el valor es inferior a 80 FU, retire y vuelva a colocar la sonda para alcanzar un valor superior a 80 FU.
NOTA: El valor, FU, es una unidad arbitraria que muestra el flujo sanguíneo cerebral (CBF).
6. Inducción de hemorragia subaracnoidea (HSA)
- Inserte la aguja suavemente a través del cráneo en la línea media entre los hemisferios hasta que se sienta resistencia de la base del cráneo. Retraiga la aguja 1 mm para asegurar la colocación correcta justo antes del quiasma óptico.
- Gire la aguja 90° en el sentido de las agujas del reloj para que la punta de la aguja apunte hacia la derecha para garantizar el resultado más homogéneo al inyectar la sangre. Retire el estilete (Figura 1).
- Equilibre durante 15 minutos y ajuste el nivel de anestesia para obtener una presión arterial media en el rango de 80-100 mmHg.
- Realiza un análisis de gases en sangre. Ajuste el nivel de anestesia en consecuencia.
- Extraiga 500 μl de sangre del catéter de cola con una jeringa de 1 ml con una aguja roma de 23 g.
- Llene el espacio muerto de la cámara de la aguja espinal con sangre para evitar la inyección de aire. Retire la aguja de 23 g de la jeringa llena de sangre y confirme que la jeringa contiene 300 μL de sangre.
- Conecte la jeringa a la aguja espinal. Agarre firmemente e inyecte la sangre manualmente para superar el MAP.
- Observe un aumento pronunciado en ICP y una caída pronunciada en CBF en la computadora portátil.
NOTA: El CBF debe ser del 50% o menos en comparación con la puntuación basal durante al menos 5 minutos para que la cirugía sea exitosa, ver Figura 2. Las ratas simuladas no se someten a los pasos 6.1-6.7, por lo que omiten la introducción de la aguja espinal en el cerebro, minimizando la posible hemorragia espontánea y el daño cerebral iatrogénico.
