Medición de Múltiples Parámetros Mitocondriales en Neuronas mediante Citometría de Flujo

Abstract

Fuente: Liang, K. X., et al. Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas humanas y sus derivados neurales y gliales. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra el marcaje de células neuronales con anticuerpos para complejos de cadenas respiratorias mitocondriales, proteínas asociadas al ADN mitocondrial y proteínas de la membrana externa mitocondrial, seguido de citometría de flujo para cuantificar sus niveles.

Protocol

1. Medición por citometría de flujo de subunidades complejas MRC (cadena respiratoria mitocondrial) y TFAM (factor de transcripción mitocondrial A) en células fijas

1. Al final del período de cultivo, separe las células (~ 10⁶) agregando el reactivo de disociación celular; luego, granule y recoja las células en un tubo de 15 mL. Lavar las células por centrifugación con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x) dos veces centrifugando a 300 × g durante 5 min.
2. Fijar las células en paraformaldehído (PFA) al 1,6% (1 mL de PFA al 1,6% en un tubo de 15 mL) a temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces centrifugando a 300 × g durante 5 min.
3. Permeabilizar las células con metanol al 90% frío como hielo (1 mL de metanol al 90% en un tubo de 15 mL) a -20 °C durante 20 min.
4. Bloquee las muestras en tampón de bloqueo que contiene 0,3 M de glicina, 5% de suero de cabra y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) - Fracción V en PBS (1x) (1 mL de tampón de bloqueo en un tubo de 15 mL). Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces.
5. Incubar las células con los siguientes anticuerpos primarios durante 30 min: anti-NDUFB10 (1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo I, anti-succinato deshidrogenasa complejo flavoproteína A (SDHA, 1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo II y anti-COX IV (1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo IV, y anti-TFAM (factor de transcripción mitocondrial A) conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400). Teñir el mismo número de células por separado con el anticuerpo anti-TOMM20 (translocasa de la membrana mitocondrial externa 20) conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400) durante 30 min (1 mL de solución de anticuerpo primario en un tubo de 15 mL; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los anticuerpos).
6. Lave las células con PBS (1x) una vez con centrifugación a 300 × g durante 5 min. Añada el anticuerpo secundario (1:400) en tubos de NDUFB10, SDHA y COX IV e incube las células con estas soluciones durante 30 min.
7. Lavar las células con PBS (1x) una vez centrifugando a 300 × g durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes, dejando aproximadamente 100 μL en los tubos. Vuelva a suspender los pellets de celda en 300 μL de PBS (1x). Transfiera las células a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que se mantienen en la oscuridad sobre hielo.
8. Analice las celdas en el citómetro de flujo (con una configuración de láser de 3 azules y 1 rojo). Detecte señales en el filtro 1 (FL1) utilizando un filtro de paso de banda 530/30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TFAM conjugado con Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Anticuerpo primario; usar como 1:400, 2,5 μL en una solución de tinción de 1000 μL; utilizar IgG2b monoclonal de ratón Alexa Fluor® 488 como control de isotipo.
anti-TOMM20 conjugado con Alexa Fluor 488	Biotecnología de Santa Cruz	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Anticuerpo primario; usar como 1:400, 2,5 μL en una solución de tinción de 1000 μL; utilizar IgG2a monoclonal de ratón Alexa Fluor® 488 como control de isotipo.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Anticuerpo primario; usar como 1:1000, 1 μL en 1000 μL de solución de tinción; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario; utilizar IgG monoclonal de conejo como control de isotipo.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Anticuerpo primario; usar como 1:1000, 1 μL en 1000 μL de solución de tinción; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario; utilizar IgG monoclonal de conejo como control de isotipo.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Anticuerpo primario; usar como 1:1000, 1 μL en 1000 μL de solución de tinción; utilizar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-ratón IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11001) como anticuerpo secundario; utilizar IgG monoclonal de ratón como control de isotipo.
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Se utiliza para lavar los escalones
Formaldehído (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Fijación celular
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Se usa para bloquear el búfer
Albúmina sérica bovina	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Agente bloqueante para evitar la unión inespecífica de anticuerpos en ensayos de inmunotinción e ingredientes CDM