Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Medición de las señales reporteras de luciferasa, que corresponden a la escisión de la γ-secretasa de APP-C99 (proteína precursora de amiloide - fragmento de 99 aminoácidos C-terminal)
NOTA: Consulte las publicaciones anteriores para obtener descripciones detalladas de la generación de células CG (C99-Gal4).
- Siembre células CG (20.000 células/pocillo) en microplacas de 96 pocillos a un volumen final de 200 μL/pocillo en un medio de crecimiento compuesto por el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco más un 10% de suero fetal bovino (FBS), 5 μg/mL de blasticidina, 250 μg/mL de antibiótico (p. ej., zeocina) y 200 μg/mL de higromicina B.
- Cuente las células con un hemocitómetro.
- Transfiera las microplacas a una incubadora deCO2 humidificada e incube a 37 °C durante la noche.
- Retire 100 μL de medio de crecimiento de cada pocillo.
- Agregue 100 μL/pocillo de medio de crecimiento que contenga 2 μg/mL de tetraciclina con 0,2% de dimetilsulfóxido (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butiléster (DAPT) u otros inhibidores de ErbB1/ErbB2 relacionados.
- Incubar células CG tratadas en microplacas a 37 °C durante 24 h.
- Retire 150 μL/pocillo del medio de crecimiento de las microplacas.
- Añada 50 μL/pocillo de reactivo de ensayo de luciferasa (consulte la Tabla de materiales).
- Transfiera las microplacas a un lector de microplacas de luminiscencia.
- Mantenga las microplacas a temperatura ambiente durante 5 minutos con una agitación suave.
- Determine la luminiscencia emitida por la luciferasa Firefly (FL) utilizando un programa predefinido almacenado en el lector de microplacas de luminiscencia.
