Inmunohistoquímica para la identificación de la región del locus coeruleus en secciones de cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Schmidt, K. et al., Localización del locus coeruleus en el cerebro del ratón. J. Vis. Exp. (2019)

Este protocolo describe el uso de la inmunohistoquímica para identificar regiones del locus coeruleus en secciones del cerebro de ratón. Al dirigirse a la dopamina β-hidroxilasa con anticuerpos marcados con fluoróforos verdes, las neuronas productoras de norepinefrina se visualizan como fluorescencia verde bajo un microscopio.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Cortar el cerebro

1. Inmovilizar y anestesiar ratones mediante la aplicación de isoflurano al 3%.
   1. Remojar una bola de algodón con gotas de isoflurano y colocarla en un tubo de microcentrífuga de 15 mL. Coloque la nariz del animal en el tubo y permita que inhale el isoflurano. Verifique la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco de los dedos de los pies.
2. Coloque al animal boca arriba e inmovilícelo sujetando sus extremidades con un alfiler en forma de T mientras tiene acceso a su abdomen.
3. Corte al animal con tijeras quirúrgicas, cortando la piel abdominal y cortando la piel en la región del tórax. Sujeta la piel con alfileres en T. A continuación, rompe la membrana peritoneal hasta el tórax. Exponga el corazón rompiendo la cavidad torácica y cortando el diafragma.
4. Corta la aurícula derecha para permitir que la sangre fluya fuera del animal. Inserte una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 25 en el ventrículo izquierdo y perfunde con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   nota: Esto permite que la solución fluya a través de la circulación sistémica y salga a través de la aurícula derecha.
5. Retire la jeringa de 10 mL e inserte una aguja de calibre 25 conectada a la jeringa de 60 mL. Perfundir a través del ventrículo izquierdo con 50 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% helado.
   1. Prepare una solución helada de PFA al 4% diluyendo la solución de PFA al 10% en_H2O y enfriando la solución final de PFA al 4% a 4 °C.
6. Aísla la cabeza del ratón y extrae el cerebro del cráneo.
   1. Corta la piel del cuello y luego corta hacia los ojos para exponer el cráneo. Rompe el cráneo desde el cuello hasta la nariz, y luego de un globo ocular al otro. Pelar el cráneo y extirpar todo el cerebro.
7. Incubar el cerebro en PFA al 4% durante 24 h a 4 °C.
8. Transfiera el cerebro con pinzas a un tubo cónico de 50 mL lleno con 25 mL de solución de sacarosa al 30%. Manténgalo a 4 °C durante 48-72 horas hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo.
9. Corte el cerebro con una matriz cortadora de cerebro de ratón adulto coronal a través del mesencéfalo (~ 3 mm posterior de bregma). Mantenga la sección del cerebro que contiene el tronco encefálico.
   nota: Esto dará como resultado dos secciones del cerebro: una que contiene la mayor parte de la corteza (anterior al corte) y otra que contiene el tronco encefálico/cerebelo (posterior del corte). Utilice la sección del tronco encefálico para los siguientes pasos.
10. Incrustar la sección del tronco encefálico con la superficie de corte colocada en la parte inferior de un molde de inclusión, rodeada de un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT); mover el cerebro incrustado a un congelador de -80 °C y congelar durante al menos 12 h, hasta su uso posterior.
11. Corte en el criostato: coloque el molde de inclusión que contiene el cerebro en OCT en el criostato; incube en el criostato durante varias horas para ajustar la temperatura del bloque cerebral a la del criostato.
12. Retire el molde de inclusión para exponer el bloque OCT que contiene el cerebro.
13. Use hojas de afeitar para eliminar el exceso de OCT de la superficie del bloque sin tocar el cerebro.
14. Monte el bloque OCT en el mandril del criostato, exponiendo la superficie cortada del cerebro hacia el frente.
15. Ajuste la superficie de corte del cerebro para que esté orientada en paralelo a las hojas de afeitar del criostato.
16. Recorte el cerebro comenzando en la médula, cortando secciones de 100 μm rostralmente.
17. Recorte rostralmente hasta que el cerebelo y el tronco encefálico se corten como una rebanada continua. Comience a recolectar rodajas de 50 μm de grosor.
    nota: A medida que se recorta rostralmente desde la médula, el tronco encefálico y el cerebelo se cortan como dos secciones separadas. En las secciones rostrales, el tronco encefálico y el cerebelo eventualmente se fusionarán a nivel del 4º ventrículo. Una vez que los bordes laterales del 4º ventrículo estén bien formados, entonces el cerebelo y el tronco encefálico saldrán como un corte continuo.
    1. Recoja un corte de cerebro rodeado de OCT con pinzas y colóquelo en un pocillo de una placa de 24 pocillos llena de PBS (Figura 1a). El locus coeruleus (LC) será más prominente cuando el cerebelo y el colículo inferior se encuentren a ~-5.52 mm posterior del bregma (Figura 2b).
       nota: La parte más anterior del LC desaparecerá una vez que el cerebelo haya sido completamente seccionado y ya no rodee el colículo inferior a ~-5,34 mm posterior del bregma (Figura 2c).

2. Inmunohistoquímica para la dopamina β-hidroxilasa (DBH) o tirosina hidroxilasa (TH) (Figura 1)

1. Día 1
   1. Lave las rodajas seleccionadas tres veces durante 5 minutos en PBS.
   2. Permeabilizar durante 24 h en solución salina tamponada con fosfato al 0,5% con detergente (PBSD) a 4 °C.
      1. Diluir 125 μL de detergente en 25 mL de PBS.
2. Día 2
   1. Lave las rodajas tres veces durante 5 minutos con PBSD al 0,5%.
   2. Añadir el anticuerpo primario, anti-DBH o anti-TH, durante 18 h a una dilución de 1:500 en PBSD al 0,5% a 4 °C.
3. Día 3
   1. Lave las rodajas tres veces durante 10 minutos en PBSD al 0,5%.
   2. Añadir el anticuerpo secundario deseado (488 burro anti-conejo para fluorescencia verde) a una dilución de 1:1000 en PBSD al 0,5% durante 16 h.
   3. Envuelva la placa de 24 pocillos en aluminio y colóquela a 4 °C.
   4. Lave las rodajas tres veces durante 5 minutos con PBSD al 0,5%.
   5. Lavar durante 5 min en PBS.
   6. Transfiera las rodajas con un pincel de lápiz a un recipiente con agua.
   7. Monta rebanadas que flotan en el agua en toboganes cargados.
   8. Secciones de cubreobjetos con medios de montaje rígidos Dopamina beta-hidroxilasa
   9. Seque las secciones de cerebro montadas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   10. Visualice cortes de cerebro en un microscopio confocal o fluorescente con ajustes para detectar señales de la longitud de onda de fluoróforo de anticuerpos secundarios adecuada.
   11. Ajuste el microscopio al plano focal del corte de cerebro y tome una sola imagen con un aumento de 10X.

Resultados

Figura 1: Detección de LC mediante inmunotinción de cortes de cerebro para DBH o TH. (a) Un cerebro de ratón se seccionó en rodajas de 50 μm alrededor del tronco encefálico y se recogió en dos platos de 24 pocillos. Cada 5º a 8º corte de cerebro recolectado se montó en un cubreobjetos cubierto de película para obtener imágenes a través de XFM. Estas rodajas están etiquetadas con números azules entre...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz de corte de cerebro de ratón adulto	Instrumentos Zivic	BSMAS001-1
Anticuerpo secundario anti-conejo, Alexa Fluor 488 (fuente - burro)	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Portaobjetos de vidrio cargados	Genesee	29-107
Microscopio confocal	Zeiss	LSM 800
Criostato	Microm GmbH	HM 505E
Cuchillas de corte Cryostat	Thermo Fisher Scientific	MX35
Tijeras Mini, 9.5cm	Antech Diagnostcs	503241
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Anticuerpo de dopamina β-hidroxilasa (DBH) - producción propia (fuente - conejo)	B. Eipper	-
Anticuerpo de dopamina β-hidroxilasa (DBH) - disponible comercialmente (fuente - conejo)	Señalización celular	8586
Tubos Falcon, 50ml	USA Scientific	339652
Forano (isofluorano)	Baxter	NDC 1019-360-60
Pinzas Micro Adson	Antech Diagnostcs	501245
Medios de montaje rígidos	Ciencias EM	17984-24
Microscopio	Pascal	LSM 5
Placas de pocillos múltiples, 24 pocillos	Thermo Fisher Scientific	930186
Compuesto de temperatura óptima de corte (OCT)	VWR/ tecnología de tisú	102094-106
Paraformaldehído (PFA)/ formalina 10%	Fisher Scientific	SF98-4
Moldes de inclusión desechables Peel-A-Way	Polysciences Inc.	18646A
Pincel de lápiz
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Tecnología de la vida	14190250
Hojas de afeitar	Amazonas	ASIN: B000CMFJZ2
Espátulas	Antech Diagnostcs	14374
T pines	Depósito de oficinas	344615
El cerebro del ratón en coordenadas estereotáxicas, Paxinos y Franklin, 3ª edición	Amazonas	ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (para preparar PBSD)	Sigma-Aldrich	T8787
Preadolescente 20	Sigma-Aldrich	P7949-500ml
Anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa (TH) (fuente - conejo)	EMD Millipore	AB152
Microscopio fluorescente de campo amplio	Zeiss	Axio Zoom.V16