Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de Lentivirus (Paso Opcional)
- Divida tres placas de 10 cm de células de HEK293T para cada lentivirus que se formarán en presencia de 10 ml de DMEM / 10% FBS y crezca hasta ~ 60-70% de confluencia. Cultive las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
- Transfecte los siguientes plásmidos de ADN (10 μg en total) en cada placa utilizando cualquier reactivo de transfección: 6,4 μg de vector lentiviral CAG-Flex-GFP, 1,2 μg pMD2.G (codifica VSV-g), 1,2 μg pRSV-Rev y 1,2 μg pMDLg/pRRE. Los tres vectores de empaquetamiento lentiviral están disponibles comercialmente.
nota: Este enfoque utiliza vectores lentivirales de 3ª generación, pero los vectores de 2ª generación y los plásmidos asociados también funcionarán.
- Prepare un contenedor de residuos que contenga una solución de lejía al 10% dentro de una campana con certificación BSL2 para inactivar cualquier solución o dispositivo que haya entrado en contacto con lentivirus o que lo contenga. A continuación, retire completamente el medio 4-6 horas después de la transfección en la solución de lejía, reemplácelo con el mismo volumen de medio nuevo y deje que las células crezcan.
- Después de 4 días, recoja los medios en tubos cónicos de 50 ml y centrifugue a 1.000 x g durante 15 minutos para granular cualquier residuo celular. A continuación, filtre el sobrenadante a través de una membrana de 0,45 μm. Cualquier filtro de baja unión a proteínas, como el PVDF, funciona bien. cautela: Coloque los desechos virales sólidos y líquidos en la solución de lejía.
- Cargue 30 ml de sobrenadante filtrado en tubos de ultracentrífuga y en una ultracentrífuga. Centrifugar a 100.000 x g durante 2,5 horas a 4 °C. Abra los tubos de centrífuga en una campana BSL2 y elimine el sobrenadante en lejía al 10%. Agregue ~ 100 μl de PBS al pellet, lo que produce títulos de 1x107 a 1x108 unidades infecciosas/ml. Alícuota al día siguiente y almacenar a -80 ºC. Las alícuotas de Lentivirus son estables a -80 °C durante al menos seis meses.
- Consideración importante: Muchas instituciones ahora tienen núcleos virales. Adquiera virus concentrado con un título mínimo de 1x107 unidades infecciosas/ml, para obtener resultados óptimos.
2. Ratones donantes para la disección de MGE
- Primero, configure un apareamiento temporizado entre una línea de interés que exprese Cre y un ratón de tipo salvaje (WT) o un ratón que expresará un reportero después de la recombinación mediada por Cre.
nota: Muchas líneas de Cre-driver son transgénicas y se mantienen y crían en el estado hemicigoto. Por lo tanto, solo la mitad de los embriones contendrán el transgén Cre. El ADN de los embriones se puede preparar rápidamente para una PCR corta para detectar el alelo Cre. A continuación, se pueden recolectar los embriones de Cre+ para que solo se utilice el tejido MGE del genotipo deseado. Alternativamente, se puede utilizar un reportero dependiente de Cre para seleccionar los embriones para la disección y el trasplante de MGE.
- Calcule qué día corresponderá a E13.5. Si los animales se aparearon la noche anterior, el día del enchufe es 0,5. Ordene ratones con preñez cronometrada o una hembra WT con crías P1 para cronometrar la participación de ratones (P)1 postnatales el día en que el tejido donante será E13.5. Alternativamente, establezca estos apareamientos en casa una semana antes del emparejamiento de los animales donantes.
nota: La estrategia anterior de generar embriones/crías E13.5 y P1 para el mismo día suele ser difícil de hacer de forma fiable.
3. Preparación de medios, herramientas y equipos.
- Preparar los reactivos y herramientas para la preparación de células MGE (Tabla 1).
- Prepare una superficie limpia y coloque pinzas limpias, tijeras y un bisturí microquirúrgico o pinzas finas (para una disección precisa del tejido) sobre la superficie.
- Prepare la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para la disección y el medio de águila modificado de Dulbco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS) para la transducción.
- Preincubar 20-30 ml de DMEM/10% FBS en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante aproximadamente 1 hora. La tapa debe aflojarse para permitir el intercambio de gases y el equilibrio del pH del medio.
nota: La preincubación del medio se puede preparar justo antes de comenzar la disección.
4. Preparación de la célula MGE
- Sacrifique a la rata preñada de acuerdo con un protocolo animal aprobado y retire los embriones en una placa de Petri de 10 cm que contenga HBSS helado.
- Extraiga el cerebro de cada embrión usando un endoscopio de disección (haga uno a la vez, dejando el resto de los embriones en HBSS helado) y luego proceda a cortar el tejido MGE.
nota: A continuación y en la Figura 1 se detallan los pasos clave que muestran cómo eliminar el MGE.
- Coloque el cerebro con el lado ventral hacia arriba (Figuras 1A, A'). Nota: también está bien tener la cara dorsal hacia arriba. Corta el cerebro por la mitad a lo largo del plano sagital para generar dos piezas. Se muestra un ejemplo de cerebro hemiseccionado (Figuras 1B, B'); Observe que los aspectos dorsal (la corteza suprayacente) y ventral del cerebro cubren y rodean el tejido de la eminencia ganglionar (GE).
- A continuación, con una mano dominante, sostenga unas pinzas muy finas o un cuchillo punzante (Tabla 1) mientras inmoviliza el hemisferio con pinzas sostenidas por una mano no dominante. (La cara medial del hemisferio debe estar hacia arriba). Despliega el tejido dorsal y ventral con pinzas y un cuchillo de apuñalamiento para revelar el tejido transgénico subyacente (Figura 1C y diagrama en la Figura 1C').
nota: La eliminación de algunos medios de la placa de Petri de disección puede facilitar la estabilización del tejido mientras se realiza la disección MGE.
- Realice cortes rectos con el bisturí o pinzas finas para separar el CGE, el LGE y los tejidos septales (véanse ejemplos de cortes marcados por líneas discontinuas rojas, Figuras 1D y D'). Estos cortes se pueden hacer en cualquier orden.
nota: Imagínese el MGE como una "caja" que se corta del tejido circundante. Hacerlo ayuda a realizar cortes similares de forma reproducible para cada disección, lo que reduce la variabilidad en las disecciones de tejido.
- Finalmente, gire el MGE de lado y recorte la parte inferior (lo que era el aspecto lateral del cerebro). Esto elimina la zona del manto del MGE (descartar en las Figuras 1E y 1E') del resto del MGE. El aspecto restante de la MGE contiene principalmente partes de la zona ventricular y la zona subventricular de la MGE, que contienen casi todas las células progenitoras de la MGE. Proceda con este pañuelo.
- Consideración importante: La adición de gel de silicona al fondo de una placa de Petri puede servir como una excelente superficie de disección, ya que protege las delicadas puntas de las pinzas y proporciona una superficie suave para sujetar el tejido con pinzas.
5. Marcaje y trasplante lentiviral
- Mueva los tubos de tejido MGE a una cubierta con certificación BSL2 y retire el medio.
nota: El tejido MGE es lo suficientemente grande como para ser visible y se asentará en el fondo del tubo, lo que permite que el medio frío se elimine fácil y suavemente.
- Añada ~500 μl de medio DMEM/10% FBS, que se preincubó en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C. A continuación, agregue policereno para facilitar la transducción a cada tubo a una concentración final de 8 μg/ml. Triture el tejido MGE para crear una suspensión unicelular utilizando una punta de pipeta P1000. Finalmente, agregue ~ 15-20 μl de lentivirus concentrado a cada tubo.
- Consideración importante: Una trituración de 10 a 12 veces es suficiente para romper el tejido de MGE de un solo embrión, pero es posible que se requieran más trituraciones si se agrupan varios MGE. Pruebe diferentes condiciones de trituración para determinar qué funciona mejor.
- Cierre bien cada tubo, inviértalo para mezclar y luego coloque todos los tubos en una incubadora a 37 °C. Incubar las células en lentivirus durante al menos 30 minutos y hasta 1 hora, los tiempos más largos han resultado en una disminución de la viabilidad celular. Invierta los tubos cada 10 minutos hasta que se acabe el tiempo.
- Después de la incubación con lentivirus, retire los tubos de la incubadora y centrifugue a ~ 700 x g durante 3 minutos para granular las células. En la campana BSL2, retire el sobrenadante y deséchelo en lejía al 10%. A continuación, agregue 1 ml de DMEM / 10% FBS y triture el pellet 2-3 veces para lavar, luego centrifugue nuevamente a la misma velocidad para pellet las celdas. Repita este paso de lavado 2-3 veces más para eliminar el exceso de virus.
nota: Realizar etapas de centrifugación a 4 °C; sin embargo, no se ha observado una viabilidad reducida cuando se realizan giros cortos en RT.
- Después del lavado final, retire la mayor cantidad de medios posible y coloque cada tubo en hielo. Debido a los medios residuales en los lados del tubo, ~ 2-3 μl de medio terminarán cubriendo la pastilla de células para cuando haya comenzado el procedimiento de trasplante.
6. Trasplante y validación
- Adquiera cachorros de huésped P1 y prepare el área de procedimiento rociando con etanol al 70%. Para mantener la esterilidad durante el procedimiento, se recomienda realizar estos procedimientos en una sala de procedimientos limpia y dedicada. Además, utilice herramientas quirúrgicas esterilizadas en autoclave y esterilice las superficies con las que estarán en contacto los cachorros, utilizando etanol al 70%. En la Figura 2.
se muestra un ejemplo de equipo representativo necesario para realizar los trasplantes, y un área de procedimiento representativa.
Nota: Si bien este procedimiento es una inyección de pequeños volúmenes, y no un procedimiento quirúrgico que requeriría una incisión, una herida abierta o suturas, se recomienda que se use una nueva micropipeta para cada ratón que se inyecte. Las micropipetas se esterilizan con calor cuando se extraen y biselan sobre una superficie rociada con etanol al 70% y se almacenan en un recipiente sellado.
- Genere micropipetas para que tengan un diámetro en la punta entre 40-80 μm. El seguimiento de estas dimensiones producirá resultados óptimos. Esterilizar con calor las micropipetas cuando se tiran y biselar sobre una superficie y rocíe con etanol al 70% antes de almacenar las micropipetas en un recipiente sellado.
Nota: Alternativamente, si el acceso a los dispositivos necesarios para crear estas agujas (Tabla 1) es limitado, use cualquier otro dispositivo de inyección. Sin embargo, es posible que no sean tan adecuadas como las micropipetas debido a los diferentes diámetros.
- Introduzca el aceite mineral en una jeringa de 1 ml y, con una aguja de 30 1/2 G, llene completamente la pipeta de vidrio con aceite mineral. A continuación, monte el émbolo en el dispositivo estereotáxico, luego conecte la pipeta de vidrio al dispositivo estereotáxico y cárguela en el émbolo. Con el accionamiento hidráulico, mueva el émbolo hasta la mitad de la pipeta de vidrio, eliminando el aceite mineral que se derrame con una toalla de papel limpia.
- Como alternativa al uso de una jeringa, sumerja el extremo posterior de la pipeta en aceite mineral y llénela por capilaridad. Para evitar burbujas de aire en la pipeta, mantenga una presión positiva sobre la jeringa hasta que esté completamente fuera de la pipeta de vidrio.
nota: Se pueden utilizar otros dispositivos para trasplantar con éxito células MGE. Cualquier dispositivo que pueda entregar un volumen menor o cercano a 100 nl funciona bien para este procedimiento.
- A continuación, utilice una toalla de papel estéril o cualquier material absorbente, con la esquina retorcida en una punta fina para eliminar delicadamente el exceso de medios por encima del gránulo de células MGE. Este paso concentra la densidad celular para que se puedan lograr volúmenes de inyección más pequeños. A continuación, utilice una pipeta de bajo volumen (preferiblemente P2) para extraer lentamente el pellet de celda y triturar 1-2 veces antes de mover la suspensión de celda a una superficie hidrofóbica. El volumen debe ser ligeramente inferior a 1 μl. Mueva la punta de la aguja dentro de la suspensión de celdas y, con el accionamiento hidráulico, introduzca la suspensión de celdas en la pipeta.
- Anestesiar a un cachorro P1 mediante hipotermia (envolver en un guante de látex y poner en hielo durante ~ 2-4 min). Verifique la efectividad de la anestesia con un estímulo nocivo. Pellizque la piel entre los dedos de los pies con pinzas finas: el cachorro debe no responder si se pellizca. A continuación, coloque el cachorro en un molde que se encuentra debajo del dispositivo de inyección, luego tense la piel tirando hacia atrás de la piel de la cabeza y asegurándola con cinta de laboratorio estándar><.
nota: Si bien la hipotermia es muy efectiva en ratones neonatos y da como resultado una baja tasa de mortalidad, los procedimientos deben realizarse rápidamente, ya que las crías comenzarán a recuperarse en menos de 10 minutos. Además, 4 minutos sobre hielo es un límite superior de lo que se puede tolerar. Trate de inducir la hipotermia solo una vez si se requiere un tiempo más prolongado para las inyecciones. Sin embargo, si un cachorro se recupera temprano, primero permita que el cachorro se recupere por completo antes de volver a inducir hipotermia. Además, solo induce la hipotermia una vez más para realizar inyecciones, ya que las crías se recuperarán entre 5 y 10 minutos después de la hipotermia. Esto se puede facilitar colocando a los cachorros con la camada y la mamá o colocando al cachorro en una superficie cálida para que se recupere.
- Con un dispositivo estereotáxico, coloque la punta de la pipeta de vidrio en la superficie de la cabeza del cachorro, perpendicular a la superficie de la cabeza. Cuando la pipeta esté en contacto con el cabezal, considérelo como '0'. A continuación, empuje la pipeta a través de la superficie de la piel y el cráneo hacia la corteza, luego inserte y retraiga la pipeta ~ 2 veces antes de detenerse. Para una orientación óptima de las células hacia el neocórtex, las inyecciones se realizan cuando la micropipeta se encuentra a una profundidad de 0,1 mm. Sin embargo, esto debe ser optimizado por el usuario (ver nota a continuación).
nota: Si bien esta profundidad se dirige de manera confiable a las capas neocorticales más profundas con los dispositivos descritos anteriormente, se deben probar y determinar empíricamente algunas profundidades. Además, se debe probar un rango de profundidades en diferentes posiciones rostro-caudal y medio-laterales para determinar qué profundidad es óptima en cada sitio. Además, la punción inicial debe ser rápida, ya que la penetración lenta en el neocórtex disminuye la capacidad de penetrar limpiamente en el tejido. Pruebe diferentes velocidades al iniciar este procedimiento por primera vez para encontrar lo que funciona mejor. Además, para probar las coordenadas, no existe un sustituto real para el uso de celdas marcadas, ya que los tintes no han sido confiables para denotar la posición.
- Una vez que la aguja esté en posición, gire el dispositivo hidráulico para hacer avanzar el émbolo hacia la pipeta de vidrio, empujando un volumen determinado de suspensión celular hacia la corteza. Inyecte de 50 a 70 nls por sitio. Repita este procedimiento en 3-6 sitios diferentes a diferentes niveles rostral-caudales si el objetivo es obtener una amplia distribución de células en todo el neocórtex.
nota: Los volúmenes de 100 nl o más pueden causar lesiones y dar lugar a grandes grupos de células inyectadas que no logran migrar eficientemente fuera del sitio de inyección. Por lo tanto, los volúmenes de inyección más pequeños (~ 70 nl o menos) son óptimos, en más sitios si el tiempo lo permite.
- Cuando se completen las inyecciones, retire a la cría de la etapa y márquela (el corte de los dedos de los pies es una forma confiable de identificar a las crías más tarde). Una vez que el cachorro se haya recuperado y sea capaz de moverse por sí solo (esto ocurre a los pocos minutos de retirarlo del escenario), devuélvalo a colocarlo con la madre y la camada><.
nota: Dado que este es un procedimiento mínimamente invasivo, no hay procedimientos postquirúrgicos una vez que el cachorro se mueve libremente y se calienta. Sin embargo, los cachorros deben ser revisados no solo después del procedimiento, sino también al día siguiente para asegurarse de que no tengan signos de deterioro de la salud.
- Antes de comenzar el procedimiento en el siguiente cachorro, rocíe el área con etanol al 70% para mantener un área de trabajo estéril. Permita que las crías inyectadas se desarrollen y luego evalúe el tejido en las etapas de desarrollo adecuadas.
Tabla 1. Lista de inventario de reactivos y herramientas.Un inventario de reactivos disponibles comercialmente, incluidos medios, herramientas de disección, equipos representativos para trasplantes y vectores de ADN. (n.d.) No está disponible ni es aplicable.
| Reactivos y equipos para la preparación y transducción de células MGE | Catálogo # | compañía |
| 1) | Dulbecco's Modified Eagle Medium, con glucosa alta | 12491-015 | Tecnologías de la Vida |
| 2) | Suero fetal bovino inactivado por calor | 10437-077 | Tecnologías de la Vida |
| 3) | Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), sin calcio ni magnesio | 14170-112 | Tecnologías de la Vida |
| 4) | 1,5 ml Tubos de microcentrífuga (u otros tubos de recogida con tapa) | 3810X | Eppendorf Internacional |
| 5) | Polibrene | SC-134220 | Biotecnología SantaCruz |
| 6) | Cuchillo de puñalada recto 22.5 ° (opcional) | REF 72-2201 | Corporación de especialidades quirúrgicas |
| 7) | Placa de Petri (10 cm), para disecciones de tejidos | FB0875713 | Fisher Científico |
| 8) | 2 pinzas de punta fina, como Dumont #5 | 11254-20 | Herramientas científicas finas |
| 9) | 37 °C incubadora de cultivo de tejidos con un aporte de 5% deCO2 | C150 | carpeta |
| 10) | Centrífuga de sobremesa que puede centrifugar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | | |
| 11) | Cualquier pipeta P1000 que se pueda utilizar para la trituración de células | | |
| 12) | Capucha de nivel de bioseguridad 2 | | |
| Reactivos y equipos para cultivos primarios in vitro de MGE | Catálogo # | compañía |
| 1) | Lab-TekII portaobjetos de cámara con tapa, 8 pocillos | 154941 | Termo Fisher |
| 2) | Poli-L-lisina 0.1% peso/volumen | P8920 | Sigma Aldrich |
| 3) | Laminina de ratón, 0,5-2 mg/ml | 23017-015 | Tecnologías de la Vida |
| 4) | Medio neurobasal | 21103-049 | Tecnologías de la Vida |
| 5) | B27 suplemento sin sérum | 17504044 | Tecnologías de la Vida |
| 6) | Glutamax, 100x stock | 35050-061 | Tecnologías de la Vida |
| 7) | Penicilina-Estreptomicina, 100x stock | 15070-063 | Tecnologías de la Vida |
| 8) | Glucosa, (preparar una solución al 25% en agua) | G5400 | Sigma Aldrich |
| Reactivos y equipos para el trasplante de células MGE | Catálogo # | compañía |
| 1) | 1 ml | REF 309602 | BD, Becton Dickinson y compañía |
| 2) | 30 aguja de 1/2 G | 305106 | BD, Becton Dickinson y compañía |
| 3) | Diámetro de precisión para suministrar 5 μl (viene con émbolo) | 5-000-1005 | Empresa científica Drummond |
| 4) | Parafilm | PM-999 | Policiencias, Inc. |
| 5) ** | Microscopio estereoscópico con brazo | MZ6 | Leica |
| 6) ** | Digital solo para ratones instrumento estereotáxico | 51725D | Empresa Stoelting |
| 7) ** | Micromanipulador fino hidráulico de aceite de un solo eje | MO-10 | Narishige |
| 8) | Biseladora rotativa recubierta de diamante | N.D. | Hecho en casa |
| 9) | Extractor de pipetas de aguja | 730 | Instrumentos Kopf |
| 10) | Aceite mineral | N.D. | Cualquier droguería o farmacia |
| 11) | Cualquier pipeta y puntas que puedan medir de forma fiable 1 μl de volumen | | |
| ** Estos son los modelos que utilizamos, pero muchas otras configuraciones deberían funcionar | |
| Reactivos opcionales (para hacer lentivirus) | Catálogo # | compañía |
| 1) | 25 mm, filtro de 0,45 μm | 09-719B | Fisher Científico |
| 2) | Tubos de centrífuga ultratransparentes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® |
| 3) | Lipofectamina 2000 | (Tamaño de 1,5 ml) | 11668019 | Invitrogen |
| Otros suministros disponibles comercialmente | Catálogo # | compañía |
| 1) | pMDLg/pRRE codificación de plásmido gag/pol | 12251 | Addgene |
| 2) | pRSV-Rev que codifica el plásmido Rev | 12253 | Addgene |
| 3) | pMD2.G que codifica el plásmido VSVG | 12259 | Addgene |
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene |
