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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Procedimiento prequirúrgico
- Antes de comenzar la cirugía, limpie todo con etanol al 70% para mantener las condiciones estériles. Se recomienda el soporte térmico con una almohadilla térmica.
- Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Se recomienda el uso de meloxicam SR en el momento de la inducción y de buprenorfina en el momento de la recuperación (bis in die, dos veces al día) durante al menos 24 h.
- Afeita el vello con una maquinilla quirúrgica. Fije un ratón en el adaptador de ratón y rata neonatal con barras para los oídos y una pinza nasal.
nota: Es fundamental asegurarse de que la cabeza del mouse esté asegurada en esta etapa y no se mueva de lado a lado.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
2. Cirugía estereotáxica para el implante de cánula guía
- Coloque el ratón y el adaptador de rata neonatal en el aparato estereotáxico. Haz una incisión sagital en la piel sobre el cráneo con un bisturí. Limpie la sangre y el tejido conectivo del cráneo con un hisopo de algodón húmedo.
- Determine la coordenada de la región cerebral de interés utilizando el atlas cerebral. Antes de comenzar las mediciones, asegúrese de que la línea media esté recta para que la broca se pueda mover de A a P y permanezca en la sutura de la línea media todo el tiempo><.
nota: Este artículo utiliza la coordenada (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm, D/V: -1,2 mm, 12 grados) para apuntar al hipocampo posterior.
- Nivel de cráneo A-P
- Coloque un taladro en un manipulador de un marco estereotáxico. Baje el taladro hasta que toque suavemente la lambda y registre su coordenada ventral. Repita este procedimiento para bregma.
nota: Cuando el cráneo está nivelado, la medida vertical del bregma es igual a la de la lambda. De lo contrario, ajuste la altura de la pinza nasal en consecuencia. Después de que el cráneo se nivele, registre la coordenada lateral anterior/posterior del bregma.
- Cráneo nivelado izquierda-derecha
- Mueva la broca del bregma a la coordenada (Anteroposterior [A/P]: -3,1 mm, mediolateral [M/L]: +2,0 mm), baje la broca hasta el cráneo y registre la coordenada vertical. A continuación, repita este procedimiento para la coordenada (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,0 mm).
nota: Si el cráneo está nivelado, estas medidas verticales de dos puntos equidistantes de la línea media son iguales. De lo contrario, ajuste la altura de las barras de los oídos.
- Taladre un orificio de fresa con cuidado en la coordenada objetivo (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm) para implantar una cánula guía. Si el diámetro de un orificio de rebaba no es lo suficientemente grande para la implantación de una cánula guía, perfore otro orificio que se superponga con el primero. Taladre otro orificio en el hueso parietal derecho (lado contralateral) e inserte un tornillo óseo, que ayuda a asegurar el cemento dental en 1.10 (ver Figura 1B).
- Corta una pieza de bloqueo circular de la parte posterior de la tapa de un tubo de centrífuga de 1,5 ml con una cuchilla de afeitar y haz una ''corona''. Esta corona se utiliza para evitar que el cemento dental se extienda a la piel. Colóquelo en el cráneo de modo que los agujeros de rebaba hechos en el paso 2.5 permanezcan dentro del círculo (vea la Figura 1).
- Configure un conjunto estereotáxico colocando una cánula guía en el brazo más corto de un adaptador estereotáxico y fíjelo con una tuerca ciega. Coloque el brazo más largo del adaptador estereotáxico en la pinza del electrodo. Colóquelo en el manipulador del aparato estereotáxico (ver Figura 1A).
- Gire el conjunto estereotástico dorsal-ventral (D-V) en el brazo del manipulador 12 grados (consulte la figura 1B). Mueva la cánula guía al orificio de rebaba hecho en 1.6. Inserte la cánula guía lentamente en el cerebro bajándola 1,2 mm.
nota: El ángulo de la sonda es específico del hipocampo; Otras regiones pueden requerir otros ángulos o ningún ángulo en absoluto. Consulta un atlas cerebral para obtener coordenadas precisas. Seque la superficie del cráneo, porque si no, el cemento no se pegará y la tapa de cemento puede desprenderse
- Agregue el cemento dental dentro de la corona para cubrir completamente tanto la parte metálica de la cánula guía como el tornillo óseo lo suficiente como para asegurarlos. Aplique cemento dental adicional si hay una parte del cráneo expuesta.
- Espere hasta que el cemento dental esté completamente seco (~ 12-20 min). Retire el adaptador estereotáxico de la pinza de electrodos. Retire la tuerca ciega y reemplace el adaptador estereotáxico con una sonda ficticia y apriete la tuerca ciega.
- Libere al ratón del aparato estereotáxico y aloje al ratón solo en una jaula individual.
nota: El ratón no debe dejarse desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Revise el ratón diariamente hasta el día de la microdiálisis. El ratón recibe medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) como el carprofeno si parece tener dolor. Es necesario esperar 2 semanas para los estudios de sueño-vigilia para que el ratón se habitúe al nuevo entorno, pero otros tipos de estudios pueden requerir períodos de recuperación más cortos (por ejemplo, 1-2 días).
3. Configuración de microdiálisis
- Control de calidad de las sondas: Llene una jeringa desechable de 1 ml con agua destilada y conéctela a la salida (puerto más corto) de una sonda mediante un tubo de byton. Cubra los orificios de ventilación con los dedos y presione suavemente el émbolo de la jeringa para infundir agua en la sonda. Compruebe que aparezca agua por la entrada de la sonda y que no haya fugas en la superficie de una membrana de microdiálisis.
- Activación de sondas: Sumergir las membranas de una sonda en etanol (70-100%) durante dos segundos. A continuación, vuelva a infundir agua destilada en la sonda con una jeringa.
- Preparación del tampón de perfusión: Para evitar la adhesión de las moléculas objetivo a los tubos, agregue BSA diluyendo la solución de BSA al 30% al 4% con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF: 1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 122 mM NaCl, pH = 7,35), que coincide estrechamente con la concentración de electrolitos en el LCR, inmediatamente antes de su uso. Filtre el tampón de perfusión a través de una unidad de filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,1 μm.
NOTA: El 4% de albúmina sérica bovina (BSA) mejora la recuperación de las proteínas adheridas, pero puede limitar severamente la entrega de compuestos, especialmente para los compuestos que tienen una alta unión a BSA. Esta es una ventaja de usar una concentración más baja de BSA (como 0.15%) en ciertos casos. Tenga en cuenta que BSA puede agregarse muy fácilmente cuando se agita por vórtice o placa de agitación. Estos agregados pueden obstruir las sondas o los poros de las membranas. Tenga cuidado al preparar una solución BSA para limitar esta agregación
- Prepare dos líneas separadas para la entrada y la salida (consulte la Figura 1C) y conecte ambas líneas con una aguja de conexión. Llene una jeringa desechable de 3 ml llena de tampón de perfusión y conéctela con el extremo de entrada del tubo con una aguja roma. Llene todo el tubo con un tampón de perfusión haciendo funcionar la bomba de jeringa.
- Detenga la bomba de jeringa y reemplace la aguja de conexión entre la línea de entrada y la línea de salida con una sonda de microdiálisis activada del paso 3.3 (consulte la figura 1C). Antes de este reemplazo, coloque la tuerca ciega en la sonda.
- Monte el tubo de rodillo en el tubo de salida de la bomba de rodillos. Ponga en marcha la bomba de jeringa a 10 μL/min y, a continuación, la bomba de rodillos con un caudal ligeramente más lento (9,5-9,8 μL/min). Asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire en todo el tubo, lo que puede influir en la recuperación cuando ingresan a la sonda.
- Anestesiar el ratón desde el paso 1.12 de la misma manera que en el paso 1.2. Coloca el collar de ratón alrededor de su cuello. Retire la tuerca ciega y la sonda ficticia e inserte lentamente una sonda de microdiálisis de 3.4 a través de la cánula guía y fije la tuerca ciega.
- Coloque el ratón en la jaula conectada a un sistema de movimiento libre y ate el ratón con el collar. Mantenga en funcionamiento tanto la bomba de jeringa como la bomba de rodillos al caudal indicado en el paso 3.5 durante al menos 1 h.
nota: Para lograr la recolección de ISF de animales despiertos, este artículo utiliza un sistema de movimiento libre, donde la jaula misma responde al movimiento de un animal para evitar que los tubos se retuerzan. Alternativamente, también se pueden utilizar los giratorios de líquido disponibles en varias compañías.
- Detenga primero la bomba de rodillo y luego la bomba de jeringa. Ajuste el caudal deseado. Haga funcionar la bomba de jeringa un 20% más rápido que la bomba de rodillos.
nota: Por ejemplo, si funciona a 1 μL/min, opere la bomba de jeringa a 1,2 μL/min. El caudal óptimo debe determinarse empíricamente para cada molécula.
- Recolección de muestras ISF: coloque el extremo libre del tubo de salida en el colector de fracciones refrigerado.
nota: El volumen de muestra adecuado varía en función de los ensayos utilizados para el análisis.
- Una vez finalizado el experimento, retira la sonda (anestesia al ratón según sea necesario).Maneja la recuperación del mouse de la misma manera que en el paso 2.11. Analice el ISF recolectado mediante métodos como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
- Para lavar todo el tubo después de la microdiálisis, vuelva a conectar los tubos de entrada y salida reemplazando la sonda con la aguja de conexión y pase la lejía diluida por todo el tubo y luego enjuague con agua. Séquelo y guárdelo para uso repetido.
nota: Otros tipos de tubos son aceptables, sin embargo, el BSA en tampón de perfusión puede obstruir los tubos con un diámetro pequeño, por lo que estos tubos se consideran de un solo uso. Los tubos pueden desgastarse u obstruirse después de múltiples usos, así que asegúrese de que el caudal sea constante cada vez antes de usarlos.
