Modelo de invasión tumoral basado en matriz mediante cocultivo de glioblastoma de microglía

Resumen

Fuente: Coniglio, S., et al. Ensayos de cocultivo para estudiar la estimulación de macrófagos y microglía de la invasión de glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, las células de glioblastoma y microglía se mezclan con una solución de matriz polimérica y se transfieren a un inserto de cámara porosa donde se forma un gel que incrusta las células. La microglía estimula la migración de las células del glioblastoma a través del inserto poroso, imitando la invasión de las células tumorales en el tejido circundante, las células se fijan y se preparan para su posterior análisis.

Protocolo

1. Marcaje fluorescente de células

NOTA: Etiquete las líneas celulares de glioblastoma y la microglía con tintes fluorescentes 9. Alternativamente, genere líneas celulares que expresen constitutivamente proteínas fluorescentes como GFP/RFP.

1. Coloque las células en una placa de 6 pocillos de modo que tengan un 70 a 80% de confluentez el día de la tinción. Para la línea celular de glioblastoma murino GL261 y la línea celular de glioblastoma humano U87, coloque 1 x 10⁶ y 1,5 x 10⁶ células, respectivamente, en una placa de 6 cm 24 horas antes de la tinción.
2. Prepare la solución de tinte de tinción de células fluorescentes en DMSO (dimetilsulfóxido) y agregue 5 μM de tinte al medio, ya sea medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) o medio libre de suero de macrófagos (MSFM), pozo de vórtice.
3. Incubar las células con colorante durante 30 min a 37 °C y 5% de CO₂.
4. Retire el medio que contiene colorante y agregue medios nuevos (RPMI o MSFM) a las celdas.
5. Incuba las células durante 30 min. Nota: Las células ya están teñidas y listas para ser utilizadas en el experimento.

2. Ensayo de invasión "3D" incrustante de glioma y macrófagos/microglía en matriz

1. Descongele la mezcla de matriz a 4 °C durante la noche. Realice todas las manipulaciones posteriores utilizando una matriz sobre hielo en el capó.
2. Prepare una concentración de 10 mg/ml de matriz en medio (MSFM o RPMI) con 0,3% de BSA en hielo.
   nota: La concentración de material de la matriz suele ser de alrededor de 15 mg/ml.
3. Para preparar las células (marcadas en el paso 1) para su suspensión en la matriz, retire los medios de las células por aspiración. Lave las células en un plato con 2 mM de EDTA (ácido etilendiaminérgico tetraacético)/PBS (solución salina tamponada con fosfato). Añadir 500 μl de 2 mM EDTA/PBS a las células e incubar durante 5 - 10 min a 37 °C y 5% de CO₂.
4. Vuelva a suspender las células en 5 ml de medio que contenga 0,3% de BSA.
5. Centrífuga durante 5 min a 120 x g.
6. Aspire el sobrenadante del pellet. Vuelva a suspender el pellet en un medio/0,3% de BSA de forma que la concentración de células sea igual a 1 x 10⁶ células/ml. Use un hemocitómetro para contar las células.
7. Añadir 1,5 x 10^{5 células} GL261 (en 150 μl) + 5 x 10⁴ células de microglía (en 50 μl) en un tubo de microglía de 1,5 ml. Añada 2 x 10^{5 pilas} GL261 (200 μl) en un tubo de microfuga de 1,5 ml por separado.
   nota: Las células GL261 solas sin microglía sirven como control.
8. Centrifugar las células en un microfuger durante 5 min a 120 x g.
9. Resuspender las células en 200 μl de matriz fría sobre hielo.
10. Coloque 50 μl (50.000 células) en el centro del compartimento superior del inserto de la cámara de 8 μM de tamaño de poro.
11. Incubar a 37 °C durante 30 min para que se produzca la polimerización.
12. Agregue 200 μl de medio libre de suero a la cámara superior y 700 μl de medio de crecimiento celular que contiene suero al pocillo inferior.
13. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 48 horas.
14. Después de la incubación, retire las células de la parte superior de la cámara mediante una aspiración suave y fije las cámaras colocándolas en formaldehído al 3,7% en PBS. Deje que las cámaras permanezcan en fijador durante 15 minutos a temperatura ambiente (o toda la noche a 4 °C). Retire el fijador mediante aspiración suave y reemplácelo con 500 μl 1x PBS. Continúe con la sección 4 para el análisis de imágenes.

Resultados

Figura 1: Esquema de dos protocolos diferentes para analizar la invasión de células de glioblastoma estimulada por microglía/macrófagos. El panel superior ilustra el ensayo de invasión de la cámara de matriz prerrevestida. El panel inferior ilustra el ensayo de invasión de matrices en 3D.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara de invasión Corning BioCoat Matrigel : Con matriz BD Matrigel	Corning/Fisher Scientific	Gato: 354481
Suero de macrófagos sin medios (MSFM) (500 ml)	Tecnologías de la vida	12065-074
CellTracker Tinte CMTPX Rojo	Tecnologías de la Vida/Sondas Moleculares	C34552
CellTracker Tinte CMFDA Verde	Tecnologías de la Vida/Sondas Moleculares	C2925
Línea celular GL261	Instituto Nacional del Cáncer (NCI)
Línea celular THP-1	Colección Americana de Cultivos de Tipo de Tejido	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medio (500 ml)	Life Technologies/Gibco	11875-093
Solución de formaldehído	Sigma Aldrich	F1635
Insertos de cultivo celular de membrana de policarbonato Corning Transwell (poro de 8 μM) 48 por paquete.	Corning	CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Extracto de Membrana Basal con Factor de Crecimiento Reducido, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Suero fetal de ternera (FBS)	Tecnologías de la Vida	Gato: 10500064
Albúmina sérica bovina, fracción V, tratada con choque térmico	Fisherscientific	BP1600-100
0.5M EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020