Estudio de la transmigración de linfocitos a través de una monocapa de células endoteliales microvasculares

Resumen

Fuente: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Análisis de la extravasación de linfocitos utilizando un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra una investigación experimental de la transmigración de linfocitos a través de un modelo de endotelio de barrera hematoencefálica (BBB). Se genera una monocapa de células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) in vitro, y se añaden a la monocapa células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que contienen linfocitos. A continuación, las células se incuban para permitir la transmigración de los linfocitos, y las células migradas se cuantifican mediante citometría de flujo.

Protocolo

1. Preparación de los insertos de cultivo celular

1. Recubrimiento de insertos de cultivo celular
   Nota importante: Evite tocar la membrana de los insertos de cultivo celular.
   1. Agregue 100 μL de solución de fibronectina a cada inserto de cultivo celular (Figura 1A) y un pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (pocillo de control óptico). Incubar durante al menos 3 h a 37 °C. Después de la incubación, aspire la solución de fibronectina.
   2. Añada 100 μL de suspensión de HBMEC a los insertos de cultivo celular y al pocillo de control óptico. Añada 600 μl de medio de células endoteliales-medio basal (ECM-b) al compartimento inferior de los insertos de cultivo celular. Incubar durante 3 - 4 días a 37 °C / 5% CO₂ hasta alcanzar la integridad de la barrera (Figura 1B), verificar el crecimiento celular mediante la evaluación microscópica del HBMEC en el pozo de control óptico><. nota: No se recomienda el crecimiento celular más allá de los cuatro días.

2. Ensayo de migración

1. Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
   1. Agregue 10 ml de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue 200 μl de suplemento de B27. Cuente las celdas de PBMC y centrífuga a 300 x g durante 5 min. Vuelva a suspender PBMC hasta una concentración final de 5 x 10⁶ células/mL RPMI/B27.
2. Configuración del ensayo de migración
   1. Aspire el medio desde el compartimento inferior seguido del compartimento superior de los insertos de cultivo celular que contienen monocapas confluentes de HBMEC (Figura 1A). Por donante, agregue 100 μL de suspensión de PBMC a cada uno de los insertos de cultivo celular y también a un pocillo de una placa de 24 pocillos por (control in vitro).
   2. Añadir 600 μL RPMI/B27 al compartimento inferior de los insertos de cultivo celular y 500 μL al PBMC del control in vitro e incubar 6 h a 37 °C / 5% CO_2.
3. Recolección de PBMC migrados
   1. Extraiga el inserto de cultivo celular con pinzas y enjuague cuidadosamente el fondo con 400 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin tocar la membrana. Deseche el inserto de cultivo celular.
   2. Añada 20 μL de fluorosferas de recuento de flujo (aproximadamente 1.000 perlas/μL) al compartimento inferior del inserto de cultivo celular, así como al control in vitro y mezcle bien. Transfiera 1 mL de la suspensión de PBMC resultante a los tubos de citometría de flujo.

3. Citometría de flujo

1. Preparación de la muestra
   1. Centrifugar PBMC a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Prepare la solución de anticuerpos añadiendo anticuerpos conjugados con fluorocromo a 100 μL de tampón de citometría de flujo (PBS/1% de albúmina sérica bovina [BSA]/2 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA]) por muestra. Para los resultados presentados a continuación, se utilizaron 1 μL de CD4-FITC (grupo de diferenciación de isotiocianato de 4-fluoresceína), 1 μL de CD3-PerCP/Cy5.5 (proteína de clorofila de peridina/cianina 5,5), 1 μL de CD56-PC7 (ficoeritrina cianina 7), 1 μL de CD8-A700 (Alexa fluor 700) y 1 μL de CD16-A750 (Alexa fluor 750) por muestra.
   3. Vuelva a suspender PBMC en 100 μL de la solución de anticuerpos e incube durante 30 min a 4 °C.
   4. Añadir 250 μL de tampón de citometría de flujo y centrifugar a 300 x g durante 5 min.

Resultados

Figura 1: Migración diferencial de subconjuntos de células NK a través de monocapas HBMEC inflamadas y no inflamadas.Una imagen de los insertos transwell (izquierda) e ilustración de la configuración experimental (derecha). B. Validación de las funciones de barrera HBMEC. Izquierda: tinción inmunohistoquímica de la molécula de unión estrecha ZO-1 utilizando zonula occludens-1 anti-hu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PBS	Gibco	14190-094	sin CaCl2 o MgCl2
Fibronectina 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	de plasma bovino
HBMEC	ScienCell	1000
HBMEC	Pelobiotech	PB-H-6023
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicilina/Estreptomicina	ScienCell	1001-b
Suplemento para el crecimiento de células endoteliales	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	transparente, 6,5 mm de diámetro, tamaño de poro de 3,0 μm
Placa de fondo plano de 96 pocillos	Corning	3596
B27	Gibco	17504-044	50x concentrado
Placa de 48 pocillos	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Fluorosferas de conteo de flujo	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	Bioleyenda	300430	clon UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clon N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clon 3G8
CD4-FITC	Bioleyenda	300506	clonar RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clon B9.11