Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Determinación de la zona de infarto
- Medir la zona de infarto (IZ) a las 24 h después de la oclusión de la arteria cerebral media (OCM).
nota: Las ratas que perdieron más del 20% de su peso o desarrollaron convulsiones o hemiplejia se excluyen del experimento.
- Aplicar la eutanasia a la rata reemplazando la mezcla de gases inspirada con un 20% de oxígeno y un 80% de dióxido de carbono hasta que la rata deje de respirar espontáneamente.
- Abra el tórax con una incisión lateral de 5-6 cm a través de la pared abdominal debajo de la caja torácica con tijeras y pinzas quirúrgicas.
- Realizar una incisión diafragmática a lo largo de toda la caja torácica con tijeras y pinzas quirúrgicas.
- Desplazando con cuidado los pulmones, corte a través de la caja torácica hasta la clavícula en los lados derecho e izquierdo.
- Perfusión con 200 mL de solución salina normal a través del ventrículo izquierdo del corazón.
- Perforar o incidir la aurícula derecha del corazón con unas tijeras.
- Realiza la decapitación con una guillotina y recoge tejido cerebral.
- Con unas tijeras de iris, corte desde el foramen magnum hasta el borde distal de la superficie posterior del cráneo en ambos lados.
- Separa los bulbos olfativos, las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral y la superficie dorsal del cráneo del cerebro.
- Retira el cerebro de la cabeza.
- Produzca 6 cortes de cerebro creando secciones horizontales de 2 mm de grosor con una hoja de afeitar de un solo filo de acero inoxidable sin recubrimiento de .009 ".
- Incubar durante 30 min a 37 °C con TTC al 0,05%.
- Coloque el tejido cerebral en los portaobjetos del microscopio y realice un escaneo óptico de estos 6 cortes de cerebro con una resolución de 1600x1600 dpi (ver Figura 1 para ejemplo).
- Agregue un filtro azul con un editor de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop CS2) usando la función Mezclador de canales (Ajustes de > de imagen > Mezclador de canales) y guarde la imagen en formato de archivo JPEG><.
nota: Después de aplicar el filtro azul, la imagen aparecerá en escala de grises.
- Abra la imagen guardada en ImageJ 1.37v.
nota: Este programa informático utiliza una función de umbral para aislar y calcular los píxeles que son blancos o negros (véase la Figura 2).
- Para cada uno de los 6 cortes de cerebro de la imagen, seleccione y guarde cada hemisferio (ipsilateral derecho lesionado y contralateral izquierdo no lesionado) como un archivo de imagen separado usando la herramienta "selección de polígonos" del menú principal.
- Establezca el límite para determinar la IZ mediante una función de umbral automático desde el menú principal del software ImageJ seleccionando Imagen > Ajustar > Umbral y mida el número de píxeles en cada hemisferio de un solo conjunto cerebral><.
nota: Las macros se pueden utilizar para este paso en el software ImageJ (consulte el documento complementario 1 para obtener el código). El corte es un parámetro crítico para determinar qué píxeles convertir a blanco y cuáles convertir a negro según el tono de gris (consulte la Figura 3 y la Figura 4 como ejemplos). A continuación, ImageJ compara los píxeles blancos y negros para determinar la IZ. Según el protocolo de tinción y la configuración del escáner, utilizamos un valor de corte constante de 0,220.
- Realizar la medición de la IZ corrigiendo la inflamación del tejido utilizando el método de las proporciones de los hemisferios cerebrales ipsilaterales y contralaterales (RICH) (ver ejemplo en la Figura 5).
nota: El tamaño del infarto se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.
2. Determinación del edema cerebral
NOTA: Utilice ImageJ 1.37v para la medición del edema cerebral (BE).
- Mida BE 24 h después de MCAO. Para el cálculo de BE, utilice los datos del volumen de los hemisferios izquierdo y derecho (en unidades).
- Realice el escaneo óptico con una resolución de 1600 x 1600 ppp (consulte la Figura 1 para ver un ejemplo).
- Seleccione los hemisferios cerebrales y establezca el punto de corte para determinar el EB con ImageJ 1.37v, como se describe anteriormente en las secciones 1.17-1.19.
- Exprese el área BE como un porcentaje de las áreas estándar del hemisferio contralateral no afectado, calculado por el método RICH utilizando la siguiente ecuación (ver ejemplo en la Figura 5).
nota: La extensión del EB se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.
