Evaluación de la resistencia eléctrica transendotelial en un modelo de barrera hematoencefálica in vitro

Resumen

Fuente: Kuzmanov, I., et al. Un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica utilizando espectroscopia de impedancia: un enfoque en la interacción entre células T y células endoteliales. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra un método para evaluar la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) en células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón in vitro. Un valor alto de TEER indica uniones de células endoteliales intactas, mientras que la adición de células T activadas reduce el valor de TEER, lo que refleja la interrupción de la barrera de unión.

Protocolo

1. Configuración y realización de la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER)

1. Coloque el módulo de 24 pocillos del instrumento de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) debajo de la cubierta de flujo laminar. Retire las tapas y coloque los insertos con células endoteliales microvasculares primarias de cerebro de ratón (MBMEC) en el instrumento con pinzas.
2. Pipetear 810 μl de medio fresco en el compartimento inferior de los pocillos del módulo: añádalo con cuidado entre el inserto y la pared del pocillo del módulo.
3. Cierre las tapas y coloque el instrumento en la incubadora. Conecte el instrumento a su computadora; Encienda el controlador del instrumento y abra el software.
4. Seleccione 'nueva medición' en la ventana emergente. Marque las casillas 'show TEER' y 'show Ccl'; Después de completar la primera medición, seleccione 'verificar todos los pozos' en la pestaña 'resultados' para ver todos los valores de TEER y capacitancia de la capa celular (Ccl).
5. Guarde el archivo: Archivo>Guardar como>' el nombre de su archivo'.
   NOTA: Dado que TEER y Ccl se miden continuamente de forma automatizada, controle sus valores durante un período de tres a cinco días. No es necesario cambiar el medio a menos que la viabilidad celular no sea óptima, como se visualiza por la falta de aumento de TEER.
6. Elija el punto de tiempo para el cocultivo de MBMEC con células T cuando el Ccl esté estable e inferior a 1 μF/cm² y TEER haya alcanzado su nivel máximo.
7. Inspeccione cuidadosamente los valores absolutos de TEER y Ccl y excluya los pozos en los que los MBMEC no han desarrollado monocapas lo suficientemente confluentes desmarcando dichos pozos.
8. Agrupar el resto de pozos: haga clic con el botón derecho del ratón sobre un pozo y seleccione 'añadir pozo a un nuevo pozo promedio'. Nómbralo en la ventana emergente; Haga lo mismo con todos los pozos individuales que se van a agrupar.
9. Revisar todos los pozos promedio para confirmar que todos ellos tienen las mismas condiciones iniciales antes del co-cultivo. Si algunos tienen valores absolutos de TEER o pendientes de TEER significativamente diferentes, o si los errores estándar son demasiado grandes, rehaga la agrupación.
   NOTA: La agrupación óptima de pozos proporciona una variación mínima en los valores de TEER dentro y entre los grupos experimentales.
10. En la pestaña 'experimento', presione 'pausa', desconecte el instrumento y sáquelo de la incubadora. Retire las tapas debajo de la campana de flujo laminar.
11. Prepare células T preactivadas y/o vírgenes, con o sin citocinas específicas, anticuerpos u otras sustancias, según se desee. Por ejemplo, mezcle el anticuerpo anti-interferón-interferón-gamma de ratón (IFN-γ) en ratas purificado (clon XGM1.2) con células T preparadas a 20 μg/ml por pocillo del instrumento TEER.
    NOTA: Si se utilizan sustancias como el inhibidor de la granzima B, se añaden al cultivo de células T al comienzo de la estimulación de las células T: e.g., el inhibidor de la granzima B II (Calbiochem) se mezcla con células T aisladas a una concentración final de 10 μM en dimetilsulfóxido (DMSO).
12. Retire algunos de los medios del inserto (el compartimento superior del pocillo). Ejemplo: pipetear cuidadosamente 150 μl (se debe evitar eliminar todo el medio, ya que podría alterar la monocapa MBMEC).
13. Añada linfocitos T a los MBMEC pipeteando cuidadosamente 150 μl de medio que contenga 2 x 10⁵ células/inserto.
    NOTA: Al recolectar células T preactivadas, cuente solo las células libres de Trypan Blue.
14. Cierre las tapas y vuelva a colocar el instrumento en la incubadora. Vuelva a conectar el instrumento y pulse 'reanudar medición'. Después de 24 horas, presione 'detener' en la pestaña 'experimento' y guarde el archivo (Archivo>Guardar).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	incluyendo: Módulo de celda de 24 pocillos, Controlador, PC con software cellZscope v2.2.2
Insertos de membrana Transwell - tamaño de poro 0,4 μm	Corning	3470	para la medición de TEER como lectura principal
Insertos de membrana Transwell - tamaño de poro 3 μm	Corning	3472	para la medición de TEER como control de calidad antes del ensayo de transmigración de células T
Placa de cultivo celular de 24 pocillos	Greiner	650 180	fondo plano; para el cultivo MBMEC
Placa de cultivo celular de 96 pocillos	Costar	3526	fondo redondo; para cultivo de células inmunitarias
Cámara de recuento de Neubauer	Marienfeld	MF-0640010	para el conteo de células
Colágeno tipo IV de placenta humana	Sigma	C5533	para solución de recubrimiento MBMEC
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141-5MG	para solución de recubrimiento MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	para el aislamiento de MBMEC y el medio de cultivo MBMEC
Penicilina/Estreptomicina	Sigma	P4333	para el aislamiento de MBMEC y el medio de cultivo MBMEC
Heparina	Sigma	H3393	para el medio de cultivo MBMEC
Factor de Crecimiento Básico de Fibroblastos Humanos (bFGF)	PeproTech	100-18B	para el medio de cultivo MBMEC
IMDM + 1% L-Glutamina	Gibco	21980-032	para medio de cultivo de células T
IFN-γ murino recombinante	PeproTech	315-05	para ensayos de transmigración de células T
TNF-α murino recombinante	PeproTech	315-01A	para ensayos de transmigración de células T
Anticuerpo IFN-γ purificado para ratones NA/LE	BD Biociencias	554408	clon XMG1.2; Concentración final recomendada: 20 μg/ml
Inhibidor de Granzima B II	Calbiochem	368055	concentración final recomendada: 10 μM
PE anti-ratón anticuerpo CD4	Bioleyenda	116005	clon RM4-4; para el análisis de la transmigración de células T
Solución de Trypan Blue, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	para el conteo de células