Tinción inmunohistoquímica de fibras nerviosas en el núcleo basal de Meyner del cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Singh, P., et al. Estimación estereológica de la longitud de las fibras colinérgicas en el núcleo basal de Meynert del cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la tinción inmunohistoquímica de fibras colinérgicas en el núcleo basal de la región de Meynert de secciones de cerebro de ratón. Las secciones se bloquean y se tratan con anticuerpos primarios contra la colina acetiltransferasa, seguidos de anticuerpos secundarios biotinilados. Se añaden complejos avidina-biotina-peroxidasa, que se unen a los anticuerpos secundarios, seguidos del sustrato cromogénico. A continuación, las secciones se deshidratan y se montan antes de visualizarlas bajo el microscopio.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Perfusión y procesamiento de tejidos

1. Anestesiar ratones mediante una inyección intraperitoneal con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Pellizque los dedos de los pies para confirmar la falta de respuesta antes de continuar.
2. Perfusión transcárdica con ~50 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco 0,1M helada seguida de paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón de fosfato (PB) 0,1M.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Use equipo de protección personal (EPP) cuando trabaje con PFA.
3. Extraer los sesos y sumergirlos en PFA al 4% en PB 0,1 M a 4 °C durante 24 h para la postfijación. Lavar con DPBS 3 veces.
4. Cambie a una solución de sacarosa al 15% en 0,1 DPBS durante la noche y luego a una solución de sacarosa al 30% en DPBS 0,1 M durante otras 48 h a 4 °C.
5. Retire el tejido de la solución de sacarosa y congélela en una cámara criotomímica preestablecida a una temperatura de -20 °C. Las muestras congeladas se pueden almacenar en tubos sellados a -80 °C hasta el corte.
6. Incrustar los tejidos en un medio de inclusión a temperatura óptima de corte (ver Tabla de Materiales) y montarlos en un disco de muestra. Corte secciones en serie de 30 μm de espesor en un plano coronal utilizando un criotomo y recoja todas las secciones en consecuencia en placas de cultivo de 24 pocillos llenas de solución crioprotectora (30% glicerol, 30% etilenglicol, 40% DPBS; Figura 1A-C). Conservar en un congelador a -20 °C.
   NOTA: Las secciones más gruesas (por ejemplo, 50 μm) son preferibles cuando sea posible. Asegúrese de que las secciones se mantengan en orden de corte y que todas las secciones estén completamente en crioprotector. Se puede utilizar una placa de 96 pocillos como alternativa a las placas de 24 pocillos para recoger secciones.
7. Cubra los pozos con sellador de placas para evitar la evaporación y el secado. Guarde las placas a -20 °C hasta su uso posterior. Las secciones almacenadas a -20 °C son estables durante varios meses para la inmunohistoquímica de la colina acetiltransferasa (ChAT).

2. Selección sistemática de secciones para IHQ

NOTA: Se debe realizar un estudio piloto para conocer el número total de secciones necesarias para lograr un coeficiente de error (CE) aceptable. El valor CE es una expresión de la cantidad total de error en el procedimiento de muestreo. El valor más bajo representa el error mínimo, y un valor de CE inferior a 0,1 se considera aceptable por el software utilizado aquí (consulte la Tabla de materiales).

1. Identifique la primera y la última sección de cada cerebro comparando las características morfológicas con un atlas estándar del cerebro de ratón, como Franklin y Paxinos. El núcleo basal de Meynert o NBM comienza en el bregma -0,0 mm y termina en -1,6 mm. Por lo tanto, alrededor de 50 secciones contienen NBM. El número total de secciones es uno de los parámetros necesarios durante la estereología. La selección de cada 8 secciones (SSF = 1/8) dio un total de 6-7 secciones para el análisis y produjo una CE aceptable tanto para la estimación del volumen como para la estimación de la longitud de la fibra en nuestro estudio piloto.
2. Comience aleatoriamente con una de las primeras ocho secciones y luego muestree sistémicamente cada 8 secciones hasta la última sección posterior que contenga NBM (Figura 1C).

3. Inmunohistoquímica

1. Transfiera las secciones criopreservadas a temperatura ambiente en crioprotector y luego 0.1M de tampón de fosfato (PB) en placas de 6 pocillos.
2. Lavar 3 veces en PB.
3. Incubar en 0,3% H₂O₂ en metanol durante 15 min.
4. Lavar 3 veces con solución salina tamponada con Tris (TBS).
5. Incubar en Triton X-100 al 0,25% en TBS durante 30 min.
6. Bloque con 10% de suero bovino normal (NBS) en Triton X-100 al 0,1% en TBS durante 30 min.
7. Incubar con una dilución 1:1.000 de anticuerpos primarios ChAT antihumanos de cabra (ver Tabla de Materiales) en TBS con 0,1% de Triton X-100 y 1% de NBS durante 48 h a 4 °C.
8. Lavar 3 veces en TBS a temperatura ambiente. Realice toda la incubación y el lavado posteriores a temperatura ambiente.
9. Incubar con anticuerpo secundario biotinilado anti-cabra bovino (ver Tabla de Materiales) durante 1 h.
10. Lavar 3 veces en TBS.
11. Incubar con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (ver Tabla de Materiales).
12. Lavar 3 veces en TBS.
13. Revele utilizando una solución de sustrato de peroxidasa DAB mejorada (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    PRECAUCIÓN: Se sospecha que el DAB es cancerígeno. Es tóxico por contacto e inhalación. Utilice EPI cuando trabaje con DAB.
14. Lavar la sección un par de veces con agua destilada y mantener en Tris pH = 7.6.
15. Monta las secciones en los portaobjetos gelatinizados. Todas las secciones de un pañuelo se pueden colocar en el mismo portaobjetos. Secar las secciones al aire, deshidratar 2 veces durante 5 minutos cada una con etanol al 70%, 90%, 95% y 100%, y luego limpiar las secciones con dos lavados de xileno de 10 minutos. Cubra las secciones con un medio de montaje (consulte la Tabla de Materiales).
    NOTA: El tiempo de procesamiento de deshidratación y limpieza afecta el grosor de las secciones. Por lo tanto, se deben utilizar las mismas condiciones para todas las secciones. En el presente estudio, el valor medio para el espesor final fue de 21,11 ± 0,45 μm.
16. Mantenga secas las secciones de la campana extractora. Las secciones secas están listas para la estereología.

Resultados

Figura 1: Ilustración del procesamiento y muestreo de tejidos utilizados en el presente estudio. Preparación y muestreo de muestras. (A) El cerebelo y el bulbo olfativo se retiran antes de montarlos en el disco de muestra. (B) Orientación del cerebro en el disco de muestra para el corte de la sección. Una incisión longitudinal poco profunda (marcada con una línea) en un hemisferio ayuda a identificar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit ABC	Laboratorios de vectores	PK6100
Anticuerpo anti-ChAT	Millipore, MA, Estados Unidos	AB144P
Anticaprino bovino IgG-B	Biotecnología de Santacruz	SC-2347
Suero Bovino Adulto	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos	B9433
Criostato	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, Illinois, Estados Unidos
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos	D5652
Etilenglicol	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	324558
Glicerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	G2025
Peróxido de hidrógeno	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	H1009
Kit Immpact-DAB	Laboratorios de vectores	SK4105	Solución de sustrato de peroxidasa DAB mejorada
Ketamina	Westward Pharmaceuticals, Nueva Jersey, Estados Unidos	0143-9509-01
Microscopio	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, Illinois, Estados Unidos	AF6000	Equipado con escenario motorizado y cámara digital a color IMI-tech
Temperatura óptima de corte (O.C.T.) medio de inclusión	Ciencias de la Microscopía Electrónica, Pensilvania, Estados Unidos	62550-12
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	P6148
Medio de montaje por monte	Ciencias de la Microscopía Electrónica, Pensilvania, Estados Unidos	17986-01
Tritón X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	T1503	Tris base
Clorhidrato de trizma	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	T5941	Clorhidrato de tris
Xilacina	Bayer, Leverkusen, Alemania	Rompun
Xilenos, grado histológico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056