Tinción inmunohistoquímica de fibras nerviosas en el núcleo basal de Meyner del cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Singh, P., et al. Estimación estereológica de la longitud de las fibras colinérgicas en el núcleo basal de Meynert del cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la tinción inmunohistoquímica de fibras colinérgicas en el núcleo basal de la región de Meynert de secciones de cerebro de ratón. Las secciones se bloquean y se tratan con anticuerpos primarios contra la colina acetiltransferasa, seguidos de anticuerpos secundarios biotinilados. Se añaden complejos avidina-biotina-peroxidasa, que se unen a los anticuerpos secundarios, seguidos del sustrato cromogénico. A continuación, las secciones se deshidratan y se montan antes de visualizarlas bajo el microscopio.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Perfusión y procesamiento de tejidos

1. Anestesiar ratones mediante una inyección intraperitoneal con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Pellizque los dedos de los pies para confirmar la falta de respuesta antes de continuar.
2. Perfusión transcárdica con ~50 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco 0,1M helada seguida de paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón de fosfato (PB) 0,1M.
   PRECAUCIÓN: El PFA es....

Resultados

Figura 1: Ilustración del procesamiento y muestreo de tejidos utilizados en el presente estudio. Preparación y muestreo de muestras. (A) El cerebelo y el bulbo olfativo se retiran antes de montarlos en el disco de muestra. (B) Orientación del cerebro en el disco de muestra para el corte de la sección. Una incisión longitudinal poco profunda (marcada con una línea) en un hemisferio ayuda a identificar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit ABC	Laboratorios de vectores	PK6100
Anticuerpo anti-ChAT	Millipore, MA, Estados Unidos	AB144P
Anticaprino bovino IgG-B	Biotecnología de Santacruz	SC-2347
Suero Bovino Adulto	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos	B9433
Criostato	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, Illinois, Estados Unidos
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos	D5652
Etilenglicol	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	324558
Glicerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	G2025
Peróxido de hidrógeno	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	H1009
Kit Immpact-DAB	Laboratorios de vectores	SK4105	Solución de sustrato de peroxidasa DAB mejorada
Ketamina	Westward Pharmaceuticals, Nueva Jersey, Estados Unidos	0143-9509-01
Microscopio	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, Illinois, Estados Unidos	AF6000	Equipado con escenario motorizado y cámara digital a color IMI-tech
Temperatura óptima de corte (O.C.T.) medio de inclusión	Ciencias de la Microscopía Electrónica, Pensilvania, Estados Unidos	62550-12
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	P6148
Medio de montaje por monte	Ciencias de la Microscopía Electrónica, Pensilvania, Estados Unidos	17986-01
Tritón X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	T1503	Tris base
Clorhidrato de trizma	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	T5941	Clorhidrato de tris
Xilacina	Bayer, Leverkusen, Alemania	Rompun
Xilenos, grado histológico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056