Medición de la absorción de dopamina en sinaptosomas cerebrales de ratón utilizando dopamina radiomarcada

Resumen

Fuente: Jensen, K. L., et al., Evaluación de la homeostasis dopaminérgica en ratones mediante el uso de análisis de cromatografía líquida de alta resolución y captación sinaptosómica de dopamina. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra la evaluación de la absorción de dopamina en sinaptosomas recolectados de cerebros de ratones. Describe los pasos para preparar los sinaptosomas para la absorción de dopamina a través de los transportadores de dopamina, tratarlos con concentraciones variables de dopamina radiomarcada, aislar los sinaptosomas y medir la radiactividad para cuantificar la absorción de dopamina.

Protocolo

1. Captación sinaptosómica de dopamina

NOTA: Este protocolo es para la evaluación paralela de dos cerebros, pero también se puede utilizar con éxito para realizar experimentos de captación sinaptosomal de dopamina (DA) con cuatro cerebros en paralelo.

1. preparativos
   1. Etiquete 48 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL según la Tabla 1 (24 para cada cerebro). Utilice diferentes colores para los tubos que pertenecen a cada cerebro para evitar confusiones entre las muestras.
   2. Etiquete 51 tubos de centelleo #1-51.
   3. Coloque solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre hielo. Esto se usará para mantener los cerebros fríos.
   4. Encienda la centrífuga para que se preenfríe a 4 °C.
   5. Pesar previamente dos tubos de microcentrífuga para obtener el peso exacto del tejido durante la preparación sinaptosómica (sección 2.6).
   6. Prepare el tampón de homogeneización mezclando 4 mM de HEPES y 0,32 M de sacarosa. Ajuste el pH a 7.4 y manténgalo en hielo.
      nota: El tampón de homogeneización puede mantenerse en alícuotas a -20 °C y descongelarse el día del experimento.
   7. Prepare el tampón de absorción combinando lo siguiente: 25 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,2 mM de CaCl₂, 1,2 mM de MgSO₄, 1 mM de ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM de D-glucosa (0,991 g/L). Ajuste el pH a 7.4 con NaOH (conduce a una concentración de sodio de aproximadamente 130 mM) y manténgalo en hielo.
      nota: Para 2 cerebros, prepare un tampón de absorción de 1500 ml. Prepare el tampón de absorción como una solución madre 10x sin ácido ascórbico y glucosa mantenida a 4 °C. Prepare 1x solución de trabajo fresca en el día, complementada con ácido ascórbico y glucosa. Ajuste el pH con NaOH a 7,4.
   8. Prepare el tampón de absorción + ligando combinando lo siguiente: 25 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,2 mM de CaCl₂, 1,2 mM de MgSO₄, 1 mM de ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM de D-glucosa (0,991 g/L), 1 μM de pargilina, 100 nM de desipramina, 10 nM de inhibidor de la catecol-O-metiltransferasa (COMT). Ajuste a pH 7.4 con NaOH y manténgalo en hielo.
      nota: Utilice un tampón de absorción de 50 ml y añada el ligando. Pargyline se añade para ayudar a prevenir la degradación de DA por oxidación a través de la monoaminooxidasa (MAO). Se añade un inhibidor de COMT (RO-41-0960) para prevenir la degradación de DA (catecolaminas en general) a través de COMT. La desipramina se añade para inhibir la absorción a través de los transportadores de norepinefrina y serotonina y, por lo tanto, hacer que los resultados de absorción sean específicos para el transportador de dopamina (DAT).
   9. Prepare el tampón de absorción + ligando + cocaína (coc) combinando lo siguiente: 25 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,2 mM de CaCl₂, 1,2 mM de MgSO₄, 1 mM de ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM de D-glucosa (0,991 g/L), 1 μM de pargilina, 100 nM de desipramina, 10 nM de inhibidor de COMT, 500 μM de cocaína. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH y manténgalo en hielo.
      nota: Utilice 7 mL de tampón de absorción + ligando y añada cocaína. Se añade cocaína para obtener una medición de fondo de la absorción de DA inespecífica para restar de los datos, dejando solo la absorción específica de DAT (ya que la SERT y la NET son inhibidas por la desipramina, como se ha descrito anteriormente). Alternativamente, se puede utilizar un inhibidor de DAT altamente potente y específico, GBR-12935, en su lugar.
      Importante: Mantén todo en hielo a partir de ahora.
2. Preparación sinaptosómica
   1. Sacrifica un ratón a la vez por dislocación cervical y decapitación.
   2. Corta la piel con unas tijeras para revelar el cráneo y corta cualquier exceso de tejido posterior del cráneo que quede de la decapitación. Corta el cráneo con unas tijeras pequeñas y rectas a lo largo de la sutura sagital, terminando lo más anterior posible.
   3. Coloque las dos puntas de tijera en cada ojo del ratón y corte a través del cráneo para eliminar el resto del cráneo y el cerebro intacto. Retire rápidamente el cerebro y colóquelo en PBS helado. Esto lo mantendrá frío mientras se disecciona el segundo cerebro.
   4. Usando una matriz cerebral, diseccione un corte coronal de 3 mm del cuerpo estriado (antero-posterior: +1,5 mm a -1,5 mm), seguido de una disección más fina con un punzón. Consulte la Figura 1 para ver el área del punzón.
   5. Mantenga el pañuelo en hielo en todo momento en el futuro.
   6. Transfiera el tejido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para su pesaje.
      nota: Este peso se utilizará en el paso 1.2.14.
   7. Repita los pasos 1.2.1-1.2.6 para el segundo cerebro.
   8. Una vez obtenido el peso de ambos cerebros, se transfiera el tejido a un vaso de homogeneización que contenga 1 mL de tampón de homogeneización helado.
   9. Homogeneizar el tejido utilizando un mortero accionado por motor a 800 rpm, 10 golpes uniformes.
      nota: Un golpe equivale a una acción hacia arriba y hacia abajo. La primera carrera debe ser de unos 5 s, los siguientes de 3 a 4 s. La homogeneización en medio isotónico es importante para evitar el estallido de los sinaptosomas. El uso de la fuerza y el medio isotónico adecuados permitirá que las terminales presinápticas se vuelvan a sellar encerrando el citoplasma, las vesículas sinápticas, las mitocondrias y el citoesqueleto.
   10. Transfiera el homogeneizado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y recoja el homogeneizado restante del vidrio de homogeneización enjuagándolo con 0,5 mL de tampón de homogeneización adicional.
   11. Mantenga la muestra en hielo mientras se homogeneiza el tejido del otro cerebro. Ejecute los dos cerebros en paralelo en los pasos 1.2.12-1.2.13.
   12. Granular los núcleos y restos celulares por centrifugación (1.000 x g, 10 min, 4°C).
   13. Transfiera el sobrenadante (S1) (que contiene membranas celulares y citoplasma) a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugue a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C.
   14. Deseche el sobrenadante (que contiene citoplasma) y vuelva a suspender el pellet (P2) (que contiene sinaptosomas crudos) en tampón de homogeneización de 40 μL/mg de tejido (según el peso obtenido en el paso 1.2.6). Vuelva a suspender suavemente la fracción sinaptosómica bruta con una pipeta p1000, ya que demasiada fuerza romperá los sinaptosomas.
       nota: Es importante terminar con al menos 280 μL. De lo contrario, será necesario diluir con más de 40 μL por mg. Los pasos 1.2.1-1.2.13 deben realizarse lo más rápido posible y todo debe mantenerse en hielo. Tan pronto como los sinaptosomas crudos se han resuspendido en el tampón de homogeneización, son bastante estables mientras se mantengan en hielo.

2. Experimento de absorción

1. Agregue 440 μL de tampón de absorción + ligando + cocaína a los 12 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL designados y 440 μL de tampón de absorción + ligando a los 36 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL restantes (consulte la Tabla 1 para el diseño)
   nota: Sácalos del hielo 15 minutos antes del inicio del experimento para que alcancen la temperatura ambiente, pero mantenlos en hielo hasta entonces para conservar los inhibidores.
2. Prepare la curva de saturación (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (dopamina 3-H) (91,1 Ci/mmol) a varias concentraciones finales (0,031, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 y 1,0 μM)).
   1. Etiquete seis tubos de microcentrífuga de 2 mL como 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 y 0,31.
   2. Añada 750 μL de tampón de absorción + ligando a los 5 tubos de microcentrífuga con el número más bajo.
   3. Añadir 1.455,4 μL de tampón de captación + ligando, 14,6 μL de dopamina (1 mM), 30 μl de dopamina 3-H (11 μM) al tubo marcado con 10.
   4. Transfiera 750 μL del tubo etiquetado como 10 al tubo etiquetado como 5. Mezcle bien y transfiera 750 μL de este tubo al tubo de 2,5. Repita esta dilución con los tubos restantes.
3. Enjuague previamente los filtros de microfibra de vidrio con un tampón de absorción de 4 ml después de colocarlos en un cubo de filtro de 12 pocillos.
4. Añadir 10 μL de la suspensión de membrana sinaptosómica a los primeros 24 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (véase la disposición en el cuadro 1) que contengan 440 μL de tampón. Agite el vórtice con cuidado y gire hacia abajo brevemente para asegurarse de que los sinaptosomas estén sumergidos en el tampón. Dejar a 37 ^oC durante 10 min.
   nota: Es importante ser exacto en los tiempos durante el experimento de absorción para una comparación justa entre cerebros. Use un cronómetro para mayor precisión.
5. Añadir 50 μL de dopamina a las concentraciones 10 y 5 μM (sección 2.2) a las dos primeras columnas y dejar a 37 ^oC durante 5 min agitando. Después de exactamente 5 minutos, detenga la reacción agregando 1 ml de tampón de absorción helado. Haga lo mismo con las concentraciones 2,5 y 1,25 μM (sección 2.2) y luego con las concentraciones 0,62 y 0,31 μM.
6. Agregue las muestras a los filtros de microfibra preenjuagados y lave con 5 x 4 ml de tampón de absorción helado. Cuando se hayan agregado las primeras 12 muestras a los filtros, mueva los filtros a los tubos de centelleo. Repita esto con las siguientes 12 muestras.
7. Repita los pasos 2.4-2.6 para el siguiente cerebro.
8. Prepare 3 tubos de conteo máximo colocando un filtro de microfibra en la parte inferior de los tubos de centelleo 49-51 y agregando 25 μL de la concentración máxima de dopamina en la parte superior (10 μM).
9. Deje los 51 tubos de centelleo en una campana extractora durante 1 h.
10. Añadir 3 mL de líquido de centelleo a cada tubo de centelleo y agitar vigorosamente en una coctelera durante 1 h.
11. Cuente [³H]-DA en un contador beta durante 1 min.
    1. Abra el programa y seleccione: Etiqueta: H-3, Placa/Filtro: vial de 4 mL, 4 por 6, Tipo de ensayo: Normal y Tiempo de conteo: 1 min.
       nota: Este paso se puede realizar al día siguiente si es más conveniente. Deje las muestras cubiertas con papel de aluminio durante la noche.
12. Determinación de proteínas
    1. Utilice un kit de ensayo de proteínas BCA estándar para determinar las concentraciones de proteínas de los sinaptosomas para realizar ajustes desde recuentos por minuto (cpm) hasta fmol/min/μg y para una comparación adecuada de la absorción entre muestras.

3. Análisis de datos

1. Utilice los datos del experimento de absorción para hacer una curva de saturación para cada grupo y calcule la velocidad de la reacción (V_max) y la constante de Michaelis Menten (K_M).
   nota: El valor K_M refleja la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de V_máx. En consecuencia, V_max refleja directamente la función de DAT (capacidad máxima de absorción), que depende del número de DAT en la superficie y de cómo su actividad podría ser modulada por modificaciones postraduccionales y/o proteínas que interactúan, así como de alteraciones en los gradientes iónicos. El valor K_M es una medida indirecta de la afinidad del sustrato por el transportador que, lo que es más importante, también puede ser modulada por modificaciones postraduccionales y/o proteínas que interactúan. Por lo tanto, para evaluar completamente los cambios funcionales, es importante determinar directamente los niveles de expresión superficial mediante, por ejemplo, un ensayo de biotinilación superficial.

Tabla 1: Disposición del tubo de microcentrífuga para la preparación sinaptosómica.

10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10+COC	5+COC	2.5 + COC	1.25 + COC	0.62 + CoC	0.31 + CoC

Resultados

Figura 1: Flujo de trabajo esquemático que muestra los diferentes pasos en el protocolo del experimento de absorción de DA sinaptosómico.El ratón es sacrificado por dislocación cervical, seguida de disección cerebral y colocación en una matriz cerebral. Se disecciona un corte coronal de 3 mm de espesor del cerebro, y la disección fina se realiza mediante un punzón bilateral de una pequeña área inmedi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inhibidor de COMT	Sigma Aldrich, Alemania	RO-41-0960	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
[3H]-Dopamina	Perkin-Elmer Ciencias de la Vida, Boston, MA, Estados Unidos	NET67-3001MC	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Filtros de microfibra de vidrio	GF/C Whatman, GE Healthcare Ciencias de la Vida, Buckinghamshire	1822-024	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Fluido de centelleo HiSafe	Perkin Elmer	1200-437	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
MicroBeta2	Perkin Elmer		Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
Kit de ensayo de proteínas BCA	Perforación Termocientífica	23225	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
HEPES	Sigma Ciencias de la Vida	H3375	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Sacarosa	Sigma Ciencias de la Vida	S7903	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
NaCl	Sigma Ciencias de la Vida	S3014	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
KCl	Sigma Ciencias de la Vida	P9541	Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
CaCl2	Merck KGaA	10043-52-4	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
MgSO4	Sigma Ciencias de la Vida	63065	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Ácido ascórbico	Sigma Ciencias de la Vida	A0278	Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
D-glucosa	Sigma Ciencias de la Vida	G7021	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Pargyline	Sigma Aldrich	P-8013	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Desipramina	Sigma Aldrich	D3900	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Dopamina	Sigma Ciencias de la Vida	H8502	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Cocaína	Sigma Ciencias de la Vida	C5776	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Matriz cerebral	Instrumentos ASI	RBM2000C	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico
Disruptor mecánico de teflón Cafano	Buch y Holm	Descontinuado	Para el protocolo de absorción de DA sinaptosómico (homogeneización)