Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado
1. Determinación de la proteína de unión al calcio o del contenido proteico de las interneuronas y visualización de la biocitina tras los registros electrofisiológicos y el llenado de biocitina
Nota: Al final de los registros electrofisiológicos, los cortes que contienen células llenas de biocitina se fijan durante la noche antes de los procedimientos histológicos. La solución fijadora se reemplazará con un solo cambio de tampón de fosfato de 0,1 M a la mañana siguiente si el resto del procedimiento se lleva a cabo otro día para evitar el daño tisular. La solución de fijación (paraformaldehído al 4%, solución de ácido pícrico saturado al 0,2%, solución de glutaraldehído al 0,025% en tampón de fosfato (PB) 0,1 M) debe hacerse fresca el día de los registros para obtener los mejores resultados.
- Al final del registro electrofisiológico, recoja cuidadosamente el corte que contiene la(s) célula(s) registrada(s) con un pincel y colóquelo en una olla que contenga líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF).
nota: Los detalles del protocolo utilizado para la preparación de cortes y los registros intracelulares utilizando electrodos afilados se han descrito anteriormente.
- En una campana extractora, recoja con cuidado la rodaja de cerebro con un pincel y enróllela sobre un pequeño trozo de papel de filtro de buena calidad. Coloque otro trozo de papel de filtro humedecido sobre la rebanada y coloque los dos trozos de papel de filtro húmedo en una pequeña olla de plástico que contenga 5-10 mL de solución fijadora y guárdela en la nevera durante la noche a 4 °C.
- Prepara una solución de gelatina en agua destilada. Coloque 20 ml de agua destilada en un vaso de precipitados sobre una placa caliente y caliéntela a 60 °C. Agregue progresivamente 2,4 g de gelatina al agua, espere hasta que se disuelva y deje que se enfríe a 35-40 °C antes de usar para evitar daños en los tejidos.
- Sustituya la solución fijadora por 2 mL de PB 0,1 M. Coloque la rodaja en una placa de Petri y corte el exceso de tejido con una hoja de bisturí. Coloque el tejido recortado en una placa de Petri (diámetro de 9 cm, altura de 1,4 cm), asegurándose de que quede plano sin pliegues ni arrugas, y retire el exceso de tampón con un pincel seco.
- Cubra el pañuelo con la solución de gelatina tibia y coloque la placa de Petri en un bloque congelado para enfriar rápidamente la solución.
- Usando una lámpara de ángulo equilibrado para proporcionar contraste, mire a través del costado del plato y mantenga la rebanada plana con una ligera presión de un pincel fino hasta que la gelatina comience a cuajar><.
nota: La gelatina se puede volver a derretir si el tejido no queda plano. Cualquier imperfección en la superficie de la gelatina causada por la extracción del pincel a medida que se solidifica se puede eliminar derritiendo suavemente la capa superficial moviendo la bombilla de la lámpara cerca de la superficie durante unos segundos.
- Llevar el plato de gelatina de fraguado a la nevera y dejar a 4 °C durante 30-60 min.
- En una campana extractora, corte un bloque pequeño (~ 1 x 1 cm) que contenga el tejido incrustado en gelatina del plato con una hoja de bisturí, levante el bloque con una espátula pequeña y colóquelo con cuidado en la misma solución fijadora pero fresca que se usó para fijar las rodajas durante al menos 30 minutos a 4 °C.
- Lave el bloque de gelatina en 5 mL de 0,1 M PB tres veces, séquelo con un trozo de papel y pegue el bloque con el lado hacia arriba (es decir, con el pañuelo en la parte superior) en un mandril de vibratomo con superpegamento.
- Retira el exceso de pegamento con un trozo de papel de filtro y utiliza una hoja de bisturí para cortar las esquinas del bloque, dejando una forma de diamante.
- Seccionar la loncha a 50 μm de grosor con un vibratomo y colocar cada sección con cuidado en un vial de vidrio que contenga un 10% de sacarosa.
- Tome con cuidado una sección del frasco y colóquela plana en la tapa de una placa de Petri. Con un microscopio de disección y una hoja de bisturí nueva, retire la gelatina alrededor de la sección y devuélvala a un vial que contenga 2 ml de sacarosa fresca al 10%
nota: Es crucial eliminar la mayor cantidad de gelatina posible en esta etapa para reducir la contracción del tejido durante la etapa de deshidratación (Paso 1.37).
- Crioproteja las secciones en una solución de sacarosa-glicerol a base de PB de 0,1 M a temperatura ambiente incubándolas durante 10 min en una solución de sacarosa al 10%, 20 min en una solución de sacarosa al 20%-6% de glicerol dos veces y, finalmente, 30 min en una solución de sacarosa al 30%-12% de glicerol dos veces bajo agitación constante.
- Coloque las secciones planas sobre un pequeño rectángulo de papel de aluminio con un pincel. Retire el exceso de líquido de las secciones y doble con cuidado el papel de aluminio en un paquete.
- Sostenga el paquete cerca de la superficie de nitrógeno líquido sin tocar la superficie durante 30 s y luego deje que las secciones se descongelen por completo durante aproximadamente 30 s. Repita la congelación-descongelación otras dos veces.
- Retire todas las secciones con un pincel y colóquelas en un vial de vidrio que contenga 2 mL de PB 0,1 M bajo agitación constante para lavar el exceso de sacarosa.
- Retirar el PB con una pipeta Pasteur e incubar las secciones en 2 mL de peróxido de hidrógeno acuoso al 1% (H2O2) durante 30 min. Lavar las secciones en 2 mL de PB 0,1 M 3x 5 min.
- Retirar el PB 0,1 M con una pipeta Pasteur y añadir borohidruro sódico (NaBH4) al 1 % en PB.
nota: No tape el vial, ya que la solución de NaBH4 emite gas hidrógeno.
- Retire el borohidruro de sodio con una pipeta Pasteur y lave bien las secciones en 2 mL de 0,1 M PB 5x 5 min.
- Sustituya el 0,1 M de PB por un 10% de suero de cabra normal (NGS) en 0,1 M de PB durante 30 min.
- Retirar el suero de cabra e incubar las secciones durante la noche a 4 °C en una mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón y policlonales de conejo constituidos en solución ABC.
nota: En la Tabla 1 se muestra una lista de los anticuerpos primarios utilizados en estudios previos.
- Incubar las secciones durante 2 h en la oscuridad en una mezcla de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (Tabla de Materiales).
- Monte las secciones en las guías en el medio de montaje y cúbralas con un cubreobjetos.
- Tome imágenes del marcaje de fluorescencia con un aumento de 40X (Figura 1Bb).
- Después de la imagen de fluorescencia, coloque el portaobjetos en una placa de Petri de vidrio que contenga PBS y retire con cuidado el cubreobjetos. A continuación, lave las secciones del portaobjetos con pulsos suaves de PBS de una pipeta Pasteur. Coloque las secciones en un frasco de vidrio limpio que contenga PBS.
- Realice la reacción avidina-HRP incubando primero las secciones en ABC durante al menos 2 h para amplificar el producto de la reacción HRP.
- Prepare la solución de 3,5 diaminobenzidina (DAB) añadiendo un comprimido a 5 mL de agua destilada.
- Lave las secciones con PBS tres veces durante 10 minutos y luego con el tampón Tris dos veces durante 10 minutos. Retire el tampón Tris después del último lavado.
- Agregue rápidamente una gota de solución de NiCl2 (cloruro de níquel) al 8 % a la solución DAB, pipetee la solución hacia adentro y extraiga para mezclar y agregue rápidamente 1 ml de esta solución sobre las secciones. Incubar las secciones en la solución DAB/NiCl2 durante 15 min.
- Añadir 10 μL de 1% H2O2 a la solución de DAB. Deje que la reacción proceda en la oscuridad bajo agitación constante durante aproximadamente 1 a 2 minutos, y controle el etiquetado de las células llenas con un microscopio de disección.
- Detenga la reacción retirando la solución de DAB/NiCl2/H2O2 y lave las secciones con tampón Tris dos veces durante 5 min.
- En una campana extractora, coloque un pequeño círculo de papel de filtro en una placa de Petri y humedézcalo con 0,1 M PB. Levante las secciones una a la vez del frasco de vidrio con un pincel y colóquelas cuidadosamente planas sobre el papel.
- Cubra las secciones con otro círculo humedecido de papel de filtro y elimine el exceso de tampón tocando suavemente la superficie con papel de seda.
- Aplique 8-9 gotas de tetróxido de osmio al 1% en PB 0,1 M sobre el papel superior, cubra el plato y manténgalo en la campana extractora durante al menos 30 minutos, pero no más de 1 h.
- Abra la placa de Petri y levante el papel de filtro superior. Levante las secciones con cuidado una a la vez con un pincel, colóquelas en un frasco de vidrio y enjuáguelas con agua destilada dos veces.
- Deseche los desechos de tetróxido de osmio de manera adecuada. Enjuague todo el equipo desechable y colóquelo en los contenedores adecuados.
- Coloque cada sección plana sobre un portaobjetos de vidrio y cubra las secciones. Transfiera el portaobjetos a una placa de Petri, coloque un frasco de vidrio vacío sobre el cubreobjetos para mantenerlo en su lugar y cúbralo con alcohol al 50%. Después de 15 minutos, retire el portaobjetos de la solución y retire las secciones del portaobjetos. Vuelva a colocar las secciones en el portaobjetos y luego coloque el portaobjetos en alcohol al 70% durante 15 minutos. Repita el mismo proceso con una solución de alcohol al 95% y finalmente al 100%.
- Después de la etapa de deshidratación, transfiera las secciones a un frasco de vidrio que contenga alcohol al 100% en un agitador en una campana extractora. Sustituya la solución de alcohol por óxido de propileno (C, 3, H, 6O) y lávese tres veces durante 5 min. Después del último lavado, mantenga ~ 2 ml de óxido de propileno en el vial y agregue resina (proporción 1:1). Asegúrese de que la resina se disuelva y mantenga las secciones bajo agitación constante durante 30 min.
- Coloque cada sección en una plancheta de aluminio que contenga resina epoxi con un palo de madera e incube durante la noche.
NOTA: No deje las secciones en la resina más de 24 h para evitar el riesgo de dañar las secciones.
- Coloque la plancheta sobre una placa caliente durante aproximadamente 10 min. Levante cada sección con un palo de madera y colóquelas en un portaobjetos limpio. Mantenga la orientación de cada sección consistente usando un microscopio de disección. Coloque un cubreobjetos sobre las secciones. Coloque el portaobjetos en el horno durante 48 h a 56 °C para su curado.
Tabla 1: Tabla de soluciones.
| Soluciones utilizadas | Composición/Instrucciones |
| Solución de fijación | Paraformaldehído al 4%, solución de ácido pícrico saturado al 0,2%, solución de glutaraldehído al 0,025% en tampón de fosfato (PB) 0,1 M |
| Tampón de fosfato 0.1M pH 7.6 | Agregue 100 mL de tampón de fosfato 1 M a 900 mL de agua destilada |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4/7,5 | Agregue 10 mL de tampón de fosfato 0.1M, 0.2 g de KCl y 8.76 g de NaCl a 990 mL de agua destilada |
| Tampón TRIS pH 7.5 | Disolver 5,72 g de clorhidrato de Tris y 1,66 g de Tris Base en 50 mL de agua destilada. A continuación, prepare hasta 1 L con agua destilada. |
| Solución fijadora tamponada de glutaraldehído y paraformaldehído | Paraformaldehído al 4%, solución de ácido pícrico saturado al 0,2%, solución de glutaraldehído al 0,025% en tampón de fosfato 0,1 M. |
| Solución ABC | La solución debe hacerse al menos 30 minutos antes de usar con el kit ABC. Agregue 1 gota de solución A y 1 gota de solución B a 2,5 mL de PBS. |
| Resina epoxi Durcupan: | Para hacer 20 botes: 20 g del componente A, 20 g del componente B, 0,6 g del componente C y 0,4 g del componente D- |
| Proteja la balanza de derrames cubriendo la placa con un círculo de papel de filtro. Pese cuidadosamente los reactivos en un vaso de precipitados tripour en las proporciones indicadas anteriormente. Mezcle bien revolviendo vigorosamente con dos palos de madera durante al menos 5 minutos. La mezcla debe adquirir un color marrón oscuro de densidad uniforme. Coloque el vaso de precipitados en el horno a ~50 °C durante un máximo de 10 minutos para eliminar tantas burbujas de aire como sea posible. nota: La resina comenzará a curarse si dejas el vaso en el horno más de 10 minutos. Decanta la resina en botes de plástico o jeringas de 5 ml, ponles la fecha y guárdala en el congelador a -20 °C lista para usar. |
