Evaluación de la discapacidad motora en modelos de C. elegans mediante el ensayo de locomoción radial

Resumen

Fuente: Currey, H. N., et al. Evaluación del deterioro motor en modelos de esclerosis lateral amiotrófica de C. elegans. J. Vis. Exp. (2021).

Este video demuestra el uso de un ensayo de locomoción radial para evaluar la disfunción motora en C. elegans que expresan la proteína TDP-43 humana de tipo salvaje o mutante en ELA. Los gusanos con niveles variables de expresión de TDP-43 de tipo salvaje o mutante pueden arrastrarse, y su movimiento se mide por la distancia radial recorrida desde el punto central de la placa de ensayo. El ensayo distingue entre deficiencias motoras leves, moderadas y graves en función de la distancia recorrida por las diferentes cepas de C. elegans.

Protocolo

1. Ensayo de locomoción radial

1. Prepare placas de Petri de 100 mm o 150 mm de diámetro aproximadamente hasta la mitad llenas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) y sembradas con un césped uniforme de bacterias OP50 para cubrir toda la superficie del agar.
2. Voltee las placas de ensayo NGM al revés y etiquete la parte inferior con un identificador para las cepas de C. elegans que se van a analizar, 2 placas por cepa (Figura 1A).
3. Haga un pequeño punto con el marcador en el centro de la placa invertida (Figura 1A).
4. Mientras trabaja con un microscopio de disección, transfiera de 15 a 20 gusanos emparejados por etapas al centro de la placa de ensayo directamente sobre el punto central (visible a través del NGM) usando una púa de alambre de platino (Figura 1B).
   nota: Intente transferir todos los gusanos al mismo tiempo o lo más rápido posible.
   1. Configure un temporizador durante 30 minutos después de colocar los gusanos en el centro del plato. Vuelva a colocar la tapa en el plato y déjelo a un lado (Figura 1C).
5. Continúe transfiriendo gusanos hasta que todas las cepas estén en las placas de ensayo designadas, anotando aproximadamente cuánto tiempo se tarda en transferirse entre placas (apunte a ~ 1 minuto entre placas). Mantenga todas las placas en el mismo orden en que se colocaron.
6. Después de 30 minutos, comience a anotar el primer plato.
   1. Retire la tapa y coloque la placa boca abajo debajo del microscopio de disección, de modo que la parte posterior de la placa etiquetada quede hacia arriba y el agar NGM quede entre la línea de visión y los gusanos. La placa estará al revés por el uso normal.
   2. Ajuste el enfoque del microscopio hasta que los gusanos sean visibles a través del agar.
   3. Con un rotulador de diferente color desde el punto central, coloque un pequeño punto en la ubicación de cada gusano: siga las huellas de los gusanos a través del césped bacteriano para encontrar los animales más distales.
   4. Revise el borde del plato, ya que algunos gusanos pueden terminar allí. Además, cuente y registre el número de gusanos en el punto central (Figura 1D).
7. Continúe marcando todas las placas de ensayo en orden, de modo que todas las placas tengan 30 minutos de tiempo de actividad, teniendo cuidado de tener en cuenta el tiempo que se tardó en configurar la placa. A continuación, realice mediciones manuales o digitales como se describe en los pasos 1.8 o 1.9.
8. Realice mediciones manuales con una regla.
   1. Use una regla para medir en mm, la distancia desde el punto central hasta las marcas de ubicación final para cada gusano y registre la distancia. Para ayudar a realizar un seguimiento del progreso durante la puntuación, etiquete el primer punto anotado con una pequeña línea de marcado.
   2. Registre los datos de longitud de cada punto consecutivamente girando la placa en el sentido de las agujas del reloj (Figura 1E).
9. Realice mediciones digitales utilizando un escáner e ImageJ.
   1. Con un escáner plano, escanee la parte posterior de la(s) placa(s) de ensayo junto a una regla (los números orientados hacia la superficie de exploración) (Figura 2A).
   2. Abra la imagen de la placa escaneada en ImageJ o en un programa similar.
      nota: ImageJ es un software gratuito de procesamiento de imágenes basado en Java alojado por los NIH.
   3. Haga clic en la herramienta Línea recta y luego dibuje una línea que conecte los puntos de 1 cm y 2 cm en la imagen escaneada de la regla (Figura 2B).
      nota: Mantener presionada la tecla Shift de la computadora forzará la línea al ángulo de 45° más cercano.
   4. Vaya al menú Analizar y utilícelo para establecer la escala (Analizar | Establecer escala) (Figura 2C).
   5. Ingrese la distancia conocida (10) y las unidades de longitud (mm) en las casillas correspondientes, no ajuste la distancia en píxeles. Marque Global para aplicar la misma escala a todas las imágenes que se analizan en cada sesión de ImageJ; de lo contrario, establezca la escala para cada imagen al abrirla (Figura 2D). Haga clic en Aceptar.
      nota: Se realizan los pasos 1.9.2-1.9.5 para establecer la escala de medición. Las mediciones de esta imagen ahora relacionarán automáticamente la longitud de las líneas con la relación píxel:longitud definida. Las imágenes escaneadas a 300 ppp tendrán una relación aproximada de 11,8 píxeles por mm.
   6. Utilice la herramienta Pincel para marcar justo encima del primer punto que se va a puntuar.
      nota: Este es un indicador visual para el primer gusano marcado.
   7. Utilice la herramienta Línea recta para dibujar una línea desde el punto central hasta el primer punto de datos de gusano.
   8. Haga clic en la tecla M del teclado para medir la distancia. Como alternativa, vaya al menú Analizar y elija Medir (Analizar | Medir). En ambos casos, la medición aparecerá en una nueva ventana; Esta ventana recogerá todas las medidas por imagen.
   9. Manteniendo el punto central constante, mueva el extremo de la línea que toca el primer punto de gusano al siguiente punto de gusano, moviéndose en el sentido de las agujas del reloj, y haga clic en la tecla M para medir.
   10. Continúe midiendo cada punto en el sentido de las agujas del reloj hasta que se anoten todos los puntos.
   11. Copie y pegue los datos de medición de longitud en una hoja de cálculo para guardarlos. A continuación, repita el proceso para cada imagen de placa escaneada.
       nota: Los pasos 1.9.6 - 1.9.11 miden los valores de desplazamiento del tornillo sin fin (Figura 2E-F).
10. Realizar análisis estadísticos.
    1. Combine réplicas dentro de un solo experimento para que el número total de gusanos puntuados esté entre 30 y 40 gusanos.
    2. Realizar réplicas experimentales independientes en diferentes días y con poblaciones independientes de gusanos para terminar con 3 réplicas experimentales independientes.
    3. Analice los datos utilizando análisis estadísticos apropiados, como la prueba t de Student para 2 cepas o el ANOVA de 1 vía para tres o más cepas.

Resultados

Figura 1: Flujo de trabajo del ensayo de locomoción radial. Los paneles A-E muestran los pasos generalizados del ensayo de locomoción radial. Los pasos son los siguientes: (A) Las placas NGM, con OP50 sembrado hasta los bordes, se preparan etiquetando y marcando el punto central, (B) los gusanos se colocan en el centro del agar como lo marca el punt...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C. elegans	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)	-	Adquiera sus cepas como desee, N2 es una cepa de control útil
Pipetas pasteur desechables, vidrio de borosilicato	VWR	14673-010	Pipeta de vidrio utilizada para crear un pico de gusano: sostenga la pipeta de vidrio en una mano y ~ 1 "de alambre de platino (sostenido por alicates) en la otra sobre una llama para unir.
Placas de Petri desechables, 35x10mm	VWR	10799-192	Placas de ensayo para el sistema de imágenes WormLab
Placas de Petri desechables, 60x15mm	VWR	25384-090	Placas de culata para lombrices
Placas de Petri desechables, 100x15mm	VWR	25384-302	placa de ensayo de locomoción radial estándar
Placas de Petri desechables, 150x15mm	VWR	25384-326	Placa de ensayo de locomoción radial de marco de tiempo más largo
Microscopio de disección	Leica	M80	Alcance para el mantenimiento de gusanos y la configuración de ensayos de locomoción radial
Rotuladores de punta fina	VWR	52877-810	Necesita al menos 2 colores para los ensayos de locomoción radial. Se requieren puntas finas para mayor precisión.
Escáner de cama plana	Amazonas	Epson Perfection V850	Opcional para el ensayo de locomoción radial. El protocolo asume una resolución de 300 ppp, la mayoría de los escáneres funcionarían bien
NGM (Medio de crecimiento de nematodos)	VWR	76347-412	Medio utilizado para cultivar C. elegans. Se puede hacer desde cero, véase WormBook: Mantenimiento de C. elegans
Bacterias OP50	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)	OP50	Fuente primaria de alimento para C. elegans
P1000 pipeta	VWR	76207-552	Pipettor, usado en el ensayo de natación
P1000 Consejos	VWR	83007-384	Consejos para la pipeta, utilizada en el ensayo de natación
Alambre de platino, 0,2032 mm de diámetro	VWR	BT136585-5M	Alambre de platino de calibre fino utilizado para crear un pico de gusano: sostenga la pipeta de vidrio en una mano y ~ 1 "de alambre de platino (sostenido por alicates) en la otra sobre una llama para unir.
Regla	VWR	56510-001	Necesidad de puntuar los ensayos de locomoción radial
ImagenJ	NIH	-	Software libre opcional proporcionado por los NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
Sistema de imágenes WormLab	MBF Biociencia	WormLab	El sistema de imágenes incluye Hardware de WormLab (campo claro escenario, cámara y carcasa) y el software WormLab. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- sistema