Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación
- Preparación y corte de tejidos
- Asigne las ratas aleatoriamente a tres grupos: frescas/salinas (SAL; 0,9% de NaCl), prefijadas/SAL y prefijadas/3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA; ver detalles en la tabla 1).
- Administrar tres dosis de 1 ml/kg de SAL y 10 mg/kg de MDMA por vía intraperitoneal, respectivamente, a los grupos de SAL y MDMA a intervalos de 2 horas. Permita que los animales sobrevivan al tratamiento durante 6 días.
- El día 7, administre 100 mg/kg de ketamina en combinación de 5 mg/kg de xilacina por vía intraperitoneal a las ratas para una anestesia profunda (es decir, pérdida del parpadeo de la córnea y reflejos de pinzamiento de la cola).
- Para el grupo fresco/SAL, decapita rápidamente a las ratas y extrae el cerebro para la prueba de cerebro fresco.
- Para los grupos prefijo/SAL y prefijo/MDMA, haga un corte a lo largo del esternón de unos 10 a 12 cm y luego exponga el extremo del esternón.
- Sostenga el extremo del esternón con un hemostático y corte el diafragma lateralmente a ambos lados con unas tijeras afiladas y luego corte hacia arriba a través de las costillas y paralelo a los pulmones.
- Con una mano, sostenga la punta ventral del corazón con pinzas pequeñas. Con la otra mano, perfore el ventrículo izquierdo con una aguja de jeringa de 18 G (tenga en cuenta que el lado adaptador de la aguja está conectado con una manguera de silicona en forma de Y a recipientes de SAL y paraformaldehído helados y bombas peristálticas).
- Encienda la bomba SAL al nivel medio del caudal (~5 ml/min) y perfore la aurícula derecha con las pinzas para permitir el escape de la circulación de retorno. Mantener la perfusión SAL durante 30 min.
- Encienda la bomba de paraformaldehído a nivel medio y deje que el paraformaldehído al 4% helado perfunda al animal durante 30 minutos.
- Retire el instrumento de perfusión y decapita al animal. Haga un corte posteroanterior a través de la línea media del cráneo y luego aletee el cráneo para exponer la cavidad del cráneo.
- Extraiga el cerebro con una espátula de la cavidad del cráneo y colóquelo en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga 25 ml de paraformaldehído al 4%. Mantenga el cerebro dentro del tubo que contiene paraformaldehído a 4 ºC en el refrigerador durante 24 horas.
- Mover el cerebro a un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 25 ml de solución de sacarosa al 30% a 4 ºC durante 3 días. Finalmente, guarde el cerebro dentro de bolsas de plástico a -80 °C hasta su uso.
- Monte el cerebro en un mandril con medio de inclusión y congele el medio de inclusión que contiene el cerebro en un criostato a una temperatura de -26 ºC. Corte el cerebro fresco congelado en secciones de 20 μm y el cerebro prefijado con paraformaldehído en secciones de 10 μm. Transfiera la sección a un portaobjetos de microscopio a temperatura ambiente (RT) tocando la sección con el portaobjetos.
- Secar al aire a temperatura derecha durante 4 horas. Guarde los portaobjetos de sección en una bolsa herméticamente sellada a -80 °C hasta su uso.
- deshidratación
- Tome portaobjetos del congelador a -80 °C y asigne secciones a una de tres pruebas: gen del receptor de serotonina 5-HT2A (ht2a), ppiB (gen de la peptidilprolil isomerasa B, control positivo) o dapB (gen de la dihidrodipicolinato reductasa bacteriana, control negativo); marque y etiquete las secciones con un bolígrafo (no use un lápiz). Sumerja los portaobjetos en alcohol al 100% a temperatura media durante 5 min. Seque los portaobjetos durante 5 minutos en una campana extractora.
- pretratamiento
- Pipetear 20 μl del reactivo Pretratamiento-1 (inactivación de la fosfatasa alcalina) en las secciones de los portaobjetos. Coloque los portaobjetos en un riel de rejilla en una bandeja de humedad (tenga en cuenta que la bandeja está cubierta con una tapa para mantener una humedad alta y evitar la evaporación de la solución de reacción).
- Agite suavemente la bandeja de humedad en un agitador horizontal a baja velocidad durante 10 min. Lave los portaobjetos dos veces con agua bidestilada (ddH2O) durante 2 min. Sumerja el portaobjetos en un vaso de precipitados de 200 ml que contenga 150 ml del reactivo Pretratamiento-2 (rotura de los enlaces cruzados inducidos por la fijación con paraformaldehído). Hervir los portaobjetos durante un total de 5 min a 100 ºC (restauración de la estructura del ARN inducida por el calor).
- Lave los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min. Coloque los portaobjetos en alcohol al 100% durante 5 min. Seque los portaobjetos durante 5 min en la campana extractora. Use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido (p. ej., estructuras no corticales, incluidos el tálamo y el hipotálamo, como se describe en la Figura 1).
- Pipetear 10 μl del reactivo Pretreatment-3 (aumenta la penetración de la sonda) en cada zona seleccionada y cubrir la bandeja de humedad con la tapa. Colocar la bandeja en el horno de hibridación equipado con el agitador horizontal y poner la temperatura del horno a 40 ºC; Agite suavemente la bandeja durante 30 min. Lave los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min.
2. Hibridación y amplificación
- Pipetear 10 μl de reactivos de sonda htr2a, ppiB y dapB, respectivamente, en las áreas seleccionadas. Cubra la bandeja de humedad con la tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente el agitador horizontal ajustado a baja velocidad. Incubar los portaobjetos a 40 ºC en el horno durante 2 h.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetear 10 μl del reactivo Amplification-1 en cada zona seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 min.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetear 10 μl del reactivo Amplification-2 en cada zona seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 min.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetear 10 μl del reactivo Amplification-3 en cada zona seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 min.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetear 10 μl del reactivo Amplification-4 en cada zona seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 min.
- Lave los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetee 10 μl del reactivo Amplification-5 en cada área seleccionada, agite e incube los portaobjetos a RT durante 30 min.
- Lave los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetee 10 μl del reactivo Amplification-6 en cada área seleccionada, agite e incube los portaobjetos a RT durante 15 min. Lave los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min.
3. Detección de señales
- Pipetee 10 μl del reactivo Red en cada área seleccionada (tenga en cuenta que el reactivo es una mezcla de Red-B y Red-A en una proporción de 1:60 y debe usarse inmediatamente). Coloque el portaobjetos en la bandeja de humedad en el agitador horizontal a RT y agite suavemente a baja velocidad durante 10 minutos.
- Lave los portaobjetos dos veces con (ddH2O) durante 10 min. Seque los portaobjetos a 60 ºC en el horno durante 15 min. Coloque los portaobjetos en xileno debajo de la campana extractora durante 5 min. Pipetee 20 μl de medios de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cúbralos con un cubreobjetos.