Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Cortar el cerebro
- Oriente la muestra de manera que la cara dorsal del cerebelo quede en la parte frontal. Vierta el esqueje helado ACSF (líquido cefalorraquídeo artificial), que contiene 1 μM TTX (tetrodotoxina), suficiente para sumergir el cerebelo por completo. Coloque un tubo de gas en el ACSF y comience a burbujear con la mezcla de gases O2 / CO2.
- Retire la aracnoidea con una pinza fina debajo de los binoculares. Corta el pedúnculo cerebeloso con una cuchilla y retira el tronco encefálico y el bloque de agar. Gire la bandeja 180°, de modo que la superficie dorsal del cerebelo quede frente a una hoja de afeitar.
- Coloque la cuchilla y ajuste la primera ubicación de corte. Establezca los parámetros de corte del vibratomo en lo siguiente: amplitud a 5,5, frecuencia a 85 Hz, velocidad a 3–4 y grosor de corte a 300 μm.
- Transfiera la rebanada cerebelosa en una red de nailon a una incubadora acrílica y sumerja la rebanada completamente en el ACSF oxigenado. La incubadora debe colocarse en un baño de agua que mantenga una temperatura de 26 °C.
- Guarde las rodajas durante al menos 1 hora para permitir la recuperación del daño durante el corte.
2. Grabación de patch-clamp de celda completa
NOTA: Un registro de patch-clamp requiere el siguiente equipo: un microscopio vertical con óptica de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC), un amplificador de patch-clamp, digitalizador de datos, estimulador digital, aislador, ordenador, software para la adquisición y análisis de datos, manipulador motorizado, plataforma de microscopio, mesa de aislamiento de vibraciones, jaula de Faraday, sistema de calentamiento de solución, bombas peristálticas y extractor de electrodos.
- Añadir picrotoxina (0,1 mM) al ACSF y resolverlo mediante ultrasonidos durante 3 min.
- Perfundir una cámara de registro con ACSF saturado de O2-CO2 que contenga picrotoxinas a razón de 2 mL/min. Mantenga la temperatura de la cámara de registro a unos 30 °C.
- Hacer un electrodo de registro tirando de un capilar de vidrio de borosilicato con filamento (diámetro exterior = 1,5 mm) utilizando un tirador con 4 pasos. El diámetro de la punta debe ser de alrededor de 1 μm.
- Haga un electrodo estimulante tirando del mismo capilar con el tirador con 2 pasos, luego rompa para producir una punta fina golpeando la punta contra un bloque de hierro bajo un microscopio binocular. El diámetro final debe ser de 3 a 5 μm.
- Transfiera el corte cerebeloso a la cámara de grabación y fíjelo con un peso Pt con hilos de nailon. Llene un electrodo estimulante con ACSF.
- Para la estimulación de los PF, coloque el electrodo estimulante en la superficie de la capa molecular, a unos 50 μm de distancia de la capa de células de Purkinje.
- Para la estimulación de la FQ, coloque el electrodo estimulante en la parte inferior de la capa de células de Purkinje (pasos 3.3, 3.4).
- Filtre la solución interna basada en K+ o Cs+ con un filtro de 0,45 μm. Utilice un microcargador para llenar un electrodo de registro con 8 μL de solución interna.
- Aplique una presión positiva débil al electrodo de registro antes de sumergirlo en el ACSF. Su resistencia debe ser de 2 a 4 MΩ y el potencial de unión líquido debe corregirse.
- Acérquese al cuerpo celular sano y brillante de la PC con el electrodo de registro. Empuje ligeramente la superficie de la celda de Purkinje, deje de aplicar presión positiva, luego aplique presión negativa hasta formar un sello de giga-ohmios. A continuación, establezca la configuración de toda la célula utilizando presión negativa.
- Mantenga el potencial de membrana a -70 mV y aplique un pulso de -2 mV (duración, 100 ms) a 0,1 Hz para monitorear la resistencia de entrada, la resistencia en serie y la capacitancia de entrada, continuamente. No utilice la compensación de resistencia en serie. Descarte los datos cuando la resistencia de la serie varíe en más del 15%.
3. Inducción de LTD (depresión a largo plazo)
- Estimular la capa molecular con un pulso (duración, 0,1 ms). Identificar las corrientes postsinápticas excitadoras PF (fibras paralelas) (EPSC) mediante la aplicación de un estímulo de doble pulso (intervalo entre picos (ISI) de 50 ms). El PF-EPSC debe mostrar una facilitación del pulso emparejado y un aumento gradual de la amplitud en relación con el aumento de la intensidad de la estimulación.
- Registre la respuesta de prueba del PF-EPSC aplicando un solo pulso a 0,1 Hz. Ajuste la intensidad del estímulo para que la amplitud EPSC evocada sea de alrededor de 200 pA. Evite la contaminación de la corriente a través del canal iónico dependiente del voltaje.
- Estimular la FQ en la parte inferior de la capa de células de Purkinje e identificar la EPSC provocada por la activación de la FQ (mediante la aplicación de un estímulo de doble pulso). El CF-EPSC debe mostrar una depresión de pulso pareada y de una manera de todo o nada según el aumento de la intensidad de la estimulación. Para la inducción de LTD, se debe utilizar un solo estímulo.
- Protocolo de inducción de LTD 1
- Usando un electrodo que contenga solución interna a base de K+ en condiciones de pinza de corriente, aplique un solo estímulo PF y un solo estímulo CF simultáneamente a 1 Hz durante 5 min (300 pulsos) (Figura 1A).
- Protocolo de inducción de LTD 2
- Utilizando una solución interna basada en K+ que contenga electrodos en condiciones de pinza de corriente, aplique estímulos PF dobles (ISI de 50 ms) y estímulos CF simples, ya que el segundo estímulo PF coincide con los estímulos CF a 1 Hz durante 5 min (Figura 1B).
- Protocolo de inducción de LTD 3
- Usando un electrodo que contenga una solución interna basada en Cs+ en condiciones de pinza de voltaje, aplique un estímulo PF doble (ISI de 50 ms) y un solo paso de voltaje de despolarización (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 1 Hz durante 3 min, de modo que el segundo estímulo PF sea equivalente al comienzo del paso de voltaje despolarizante (Figura 1C).
- Protocolo de inducción LTD-4
- Usando un electrodo que contenga una solución interna basada en Cs+ en condiciones de pinza de voltaje, aplique los estímulos PF (5x a 100 Hz) y un solo paso de voltaje de despolarización (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 0.5 Hz durante 3 min, simultáneamente (Figura 1D).
