Un modelo in vitro para estudiar el cruce de patógenos de la barrera hematoencefálica y la infección de células cerebrales

Resumen

Fuente: da Costa, A., et al. Un modelo de interfaz hematoencefálica humana para estudiar los cruces de barreras por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un modelo in vitro para estudiar patógenos que atraviesan la barrera hematoencefálica (BBB). Las células endoteliales microvasculares, que expresan uniones estrechas, forman una capa endotelial en la cámara superior, mientras que las neuronas, los astrocitos y la microglía representan el parénquima cerebral en la cámara inferior, separadas por una membrana porosa. La infección viral en el modelo BBB imita el paso del patógeno de la sangre al cerebro. Al introducir un virus neurotrópico, atraviesa la BBB a través de la transcitosis, infecta las células neuronales, se replica y libera progenie viral, lo que demuestra una neuroinvasión exitosa.

Protocolo

1. Construcción y control de calidad del BBB-Minibrain (Barrera hematoencefálica - Minibrain) (Figura 1)

1. Configuración de un dispositivo de inserción de cultivo de membrana de poliéster BBB-Minibrain (Figura 1B)
   1. Cultive la línea celular endotelial del cerebro humano (células hCMEC / D3) en filtros de inserción de membrana de poliéster de 12 pocillos durante 6 días en medio de células endoteliales antes de usarlos para el experimento.
   2. Cubra una placa de 12 pocillos con poli-D-lisina (1 mL/pocillo, 10 μg/mL, 4 h en RT) y luego laminina (1 mL/pocillo, 1 μg/mL, durante la noche en RT).
   3. Retire la laminina y agregue 1 mL de medio de células endoteliales suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 5% (medio de células endoteliales al 5%).
   4. Incubar durante 1 h a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.
   5. Tripsinar suavemente las neuronas humanas postmitóticas (hNeurons) y los astrocitos humanos (hAstrocytes) (NT2-N/A) y la línea celular microglial humana (CHME/Cl5) y disociar los gránulos celulares con medio celular endotelial completo.
   6. Cuente las células, mezcle 3,6 x 10⁵ NT2-N/A y 0,4 x 10⁵ células CHME/Cl5/pocillo y siembre la placa de 12 pocillos.
   7. A T=24 h (24 h después de la siembra): cambie el medio usado por medio fresco de células endoteliales completas (células Minibrain y células endoteliales) y transfiera el filtro de cultivo de membrana de poliéster hCMEC/D3 a la parte superior de las células Minibrain. Incubar el BBB-Minibrain a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.
      NOTA: El BBB-Minibrain consistirá entonces en una capa de células endoteliales humanas hCMEC/D3 en filtro que aísla el compartimento luminal (o compartimento "sanguíneo") y de un cultivo mixto de células humanas hNT2-N/A y hCHME/Cl5 (Minibrain) en el fondo del pocillo que define el compartimento abluminal (o compartimento "cerebral") (Figura 1B).
2. Validación de la permeabilidad endotelial del BBB-Minibrain (control de calidad) (Figura 1C)
   1. Prepare el tampón de transporte (TB), que es un tampón HBSS (solución salina equilibrada de Hanks) con Ca²⁺ y Mg²⁺ suplementado con 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) y 1 mM de piruvato de sodio.
   2. Prepare placas de 12 pocillos con 1,5 mL de tampón de transporte por pocillo.
   3. En T= 0, haga un tampón de transporte fresco suplementado con 50 μM de Amarillo de Lucifer (LY-TB).
   4. Invierta cada filtro al revés para eliminar cuidadosamente el medio sin afectar la barrera de células endoteliales.
   5. Coloque el filtro en la placa de 12 pocillos llena y agregue 0,5 mL de LY-TB.
   6. Incubar las placas en una incubadora a 37°C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.
   7. A T=10 min, transfiera los filtros en nuevas placas de 12 pocillos llenas de TB y mantenga el compartimento abluminal de la primera placa para la lectura de OD.
   8. A T= 25 min, repita el paso 1.2.7.
   9. A T= 45 min, detenga el transporte retirando los filtros de las placas. Mantenga los compartimentos abluminal y luminal para las medidas de OD.
   10. La transferencia en placas oscuras de 96 pocillos muestra es: 10 μL con 190 μL de TB para la LY-TB y los compartimentos luminales, 200 μL de muestra para los compartimentos abluminales.
   11. Mida la fluorescencia de la LY-TB presente en las diferentes muestras a λ428 nm, λ535 nm (ondas de longitud de excitación y emisión, respectivamente).
   12. Calcule la permeabilidad endotelial (Pe) hacia la LY-TB (Pe_LY) utilizando la fórmula:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) y Pe_LY= PSe/S.
       NOTA: PSf es la permeabilidad del filtro sin células, PSt es la permeabilidad del filtro con células, PSe es la permeabilidad de la monocapa endotelial tiempo la superficie de la monocapa, S es la superficie de la monocapa (para un filtro de 12 pocillos = 1,12 cm²), Pe_LY se expresa en cm/min. Para hCMEC/D3, el Pe_LY debe estar entre 0,7 y 1,2 x 10^-3 cm/min, dependiendo principalmente del FBS utilizado en los experimentos. Importante: un Pe_LY superior a 1,2 significa que la BBB no está lo suficientemente ajustada y se pueden observar algunas fugas. Deseche estas barreras.

2. Uso de BBB-Minibrain para resaltar la presencia de partículas virales neuroinvasivas en una muestra de vacuna contra el virus de la fiebre amarilla, el virus neurotrópico francés, YFV-FNV 34 (Figura 2)

1. Cruzamiento de BBB y multiplicación de los virus de la fiebre amarilla en el minicerebro
   1. Utilice el BBB-Minibrain preparado como se describe en el paso 1.1.7 24 horas antes de la adición del virus; reemplace el medio por medio de células endoteliales FBS al 2%.
      NOTA: Es extremadamente importante evitar cambiar el medio justo antes de agregar el virus. El cambio de medio puede activar las células endoteliales humanas y abrir transitoriamente la barrera que permitirá el paso del virus. Aquí se cambia el medio 24 h antes de comenzar el experimento.
   2. En T= 0, añadir 3500 Unidades Formadoras de Placas (PFU) de YFV-FNV diluidas en 50 μL de medio de células endoteliales FBS al 2% con mucho cuidado en la parte superior del compartimento luminal. El BBB-Minibrain de control se inocula con 50 μL de medio de células endoteliales FBS al 2% sin virus. Determine Pe_LY en el pozo complementario.
   3. Incubar el BBB-Minibrain en una incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.
   4. Después de 24 h, retire el dispositivo de filtro de insertos de cultivo de membrana de poliéster y determine Pe_LY, muestree 1 mL del compartimento abluminal y titule el virus. Reemplace el medio con medio de células endoteliales FBS fresco al 2%.
   5. Incubar el BBB-Minibrain a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.
   6. Después de 72 h, muestrear el medio del compartimento abluminal y valorar el virus, y/o extraer el ARN de las células Minibrain para el análisis de la expresión génica.

Resultados

Figura 1: modelo BBB-Minibrain. A. Horario de los cultivos de hCMEC/D3 y fotografía del dispositivo BBB-Minibrain: un filtro de inserciones de cultivo de membrana de poliéster con barrera endotelial de hCMEC/D3 se sujeta con una pinza antes de ser insertado en un pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos. B. Dibujos animados que describen el dispositivo con el compartime...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12 placas de pocillos	Corning	3336
Placa de Petri de 85 mm	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	A petición del Dr. Lafon
CMC	Calbiochem	217274
Placas oscuras de 96 pocillos	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Scientific	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
Etanol	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	medio de célula endotelial
HBSS con Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlane	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Scientific	15630-070
Laminina	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-glutamina	Thermofisher Scientific	25030-024
Lucifer Amarillo	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Scientific	21430
MEM 1X	Thermofisher Scientific	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldehído	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15714
PBS sin Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14190
PBS-Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14040-091
Pluma/Estreptococo	Eurobio	CXXPES00-07
Poli-d-lisina	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Prolongar el oro	Thermofisher Scientific	P36930
kit de purificación de ARN	QIAGEN	74104
Bicarbonato de sodio 5.6%	Eurobio	CXXBIC00-07
Piruvato de sodio	Thermofisher Scientific	11360
T75 Celda+Matraz	Sarstedt	83-1813-302	Matraz de poliestireno para cultivo de tejidos con tratamiento superficial específico (Cell+) para células adherentes sensibles
Transwell	Corning	3460	insertos de cultivo de membrana porosa de poliéster
Tripsina-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
Agua ultra pura	Thermofisher Scientific	10977-035
Versene	Thermofisher Scientific	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Vial de vacuna