1. Preparación de moscas para experimentos de FlpOut multicolor (MCFO)
NOTA: La técnica MCFO se refiere a una versión modificada de la llamada escisión de casete de parada mediada por Flp (FlpOut). Las moscas transgénicas MCFO portan un promotor de choque térmico (hsp)-Flp recombinasa y diferentes reporteros bajo el control de la secuencia de activación (UAS) aguas arriba. Cada reportero consta de una columna vertebral común de una proteína fluorescente verde (sfGFP) supercarpeta miristoilada (myr), en la que se han insertado 10 copias de una etiqueta de epítopo (por ejemplo, HA, FLAG o V5). Las proteínas no fluorescentes resultantes se denominan "GFP del monstruo de espagueti" (smGFP) y se pueden detectar utilizando anticuerpos específicos contra las diferentes etiquetas de epítopos.
- Vuelos cruzados con el casete MCFO y el hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) a las líneas de controlador GAL4 gliales apropiadas (ver Tabla de Materiales).
- Dado que el hsp ya está activo a 25 °C y pocas células pueden sufrir una recombinación que conduzca a un etiquetado inespecífico, se deben colocar cruces a 18 °C para evitar fugas en el sistema. Espere unos 20 días a 18 °C para obtener la generación F1. Después del choque térmico (ver paso 2), mantener las moscas a 25 °C (Figura 1).
2. Choque térmico
NOTA: Dependiendo del sitio de inserción, la eficiencia del hsp-Flp puede diferir; por lo tanto, se debe optimizar el tiempo óptimo de choque térmico. Para este protocolo, se ha utilizado un stock de moscas MCFO en el que se insertó la hsp-Flp en el cromosoma X (ver Tabla de Materiales).
- Transfiera la progenie de la cruz en el paso 1.1 (moscas de la generación F1, de 3-4 días de edad) a viales nuevos que contengan alimentos y aplíquelos a 37 °C en un baño >nota: Las moscas jóvenes (1-2 días de edad) son muy sensibles al choque térmico. Esperar 1 o 2 días más antes de realizar el choque térmico para reducir la tasa de mortalidad causada por el tratamiento. Utilice algunas moscas de la generación F1 como control, sin choque térmico.
- Durante el choque térmico, mantenga las moscas en viales normales con comida para disminuir la tasa de mortalidad inducida por el estrés. Coloque a las hembras y a los machos en viales separados.
- Asegúrese de sumergir todo el vial en el agua para garantizar un choque térmico homogéneo. Utilice un choque de 5-8 minutos como punto de partida adecuado para el marcaje disperso de las células gliales con muchas líneas de controlador GAL4; La duración del choque debe optimizarse para cada conductor y experimento (pueden ser necesarios tiempos de choque térmico más cortos o más largos).
- Después del choque térmico, coloque los viales horizontalmente en el banco durante unos minutos para permitir que las moscas se recuperen del choque térmico.
nota: No es necesario cambiar los viales.
- Mantenga las moscas a 25 °C y diseccione (consulte los pasos 3 y 4) 2 o más días después del choque térmico para obtener una expresión óptima del reportero.
3. Preparación y soluciones para la disección
- El día de la disección, prepare una solución fijadora fresca en tubos de PCR de 200 μL mezclando 180 μL de medio de cultivo celular S2 con 20 μL de paraformaldehído (PFA) al 20% para obtener una solución de PFA al 2%. Mantenga la solución fijadora en hielo antes y durante la disección.
cautela: El PFA es tóxico y debe manipularse con cuidado.
nota: Mezcle 160 μL de medio de cultivo celular S2 con 40 μL de paraformaldehído (PFA) al 20% en un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 200 μL para preparar una solución de PFA al 4% en lugar de una solución al 2%.
- Utilice un tubo de PCR por genotipo con un máximo de 8-10 cerebros por tubo para obtener resultados de tinción óptimos.
- Prepare la solución de lavado de cerebro para adultos: 0,5% de albúmina sérica bovina, 0,5% de Triton X-100 en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: Dependiendo de la tinción, puede ser necesaria una solución que contenga Triton X-100 al 1%. Una mayor concentración de Triton X-100 aumenta la penetración del anticuerpo en el tejido y es necesario teñir regiones que se encuentran profundamente dentro del tejido (por ejemplo, regiones sinápticas en el cerebro adulto de Drosophila).
- Prepare la solución de bloqueo: 3% de suero de cabra normal, 3% de suero de burro normal y 0,5% de Triton X-100 en PBS.
- La solución de lavado de cerebro para adultos y la solución de bloqueo pueden almacenarse a 4 °C durante unas semanas.
- Coloque la placa de vidrio de los pozos de depresión profunda sobre hielo y llene cada pocillo con las siguientes soluciones: una con etanol al 70%, una con PBS y otra con medio de cultivo celular S2.
4. Disección del cerebro en adultos
- Coloque una placa de disección de 3 cm en la platina de un microscopio estereoscópico y llénela con medio de cultivo celular S2 frío. Realice todas las disecciones en este medio para asegurarse de que el tejido permanezca sano durante el procedimiento de disección.
nota: Utilice un plato de disección forrado con varios milímetros de silicona negra que proporcione un buen contraste de fondo (en las imágenes) y conserve las pinzas durante la disección.
- Anestesiar las moscas del genotipo deseado con CO2.
- Con pinzas, agarre la mosca por las alas y lávela con etanol frío al 70 % durante 30 s, luego con PBS frío durante 30 s adicionales.
- Transfiera la mosca al pozo de depresión profunda que está lleno de medio de cultivo celular S2.
- Repita el mismo procedimiento para todas las moscas del mismo genotipo y manténgalas en un medio de cultivo celular frío S2 hasta la disección, que preservará el tejido><.
nota: Anestesiar solo el número de moscas que se pueden diseccionar en un período de tiempo de aproximadamente 30 minutos. Los tiempos de incubación prolongados en el medio de cultivo celular S2 pueden dañar el tejido.
- Agarre la mosca con pinzas y, bajo un microscopio estereoscópico, sumerja la mosca en un medio de cultivo celular S2.
- Separa la cabeza del resto del cuerpo. Deseche el cuerpo y mantenga la cabeza sumergida en el medio de cultivo celular S2. Es extremadamente importante sujetar la cabeza con pinzas durante toda la disección. Si la cabeza comienza a flotar, será difícil recuperarla sin dañar el tejido.
- Comience la disección sacando un ojo, mientras sostiene la cabeza con al menos una pinza en todo momento. Asegúrate de que la punta de las pinzas esté justo debajo de la retina para evitar dañar el tejido que se encuentra debajo. Saca el otro ojo y comienza a quitar la cutícula hasta que aparezca el cerebro.
- Retire todo el tejido traqueal y la cutícula alrededor del cerebro hasta que el tejido parezca limpio. Asegúrese de eliminar todo el tejido traqueal alrededor del cerebro para obtener resultados óptimos de tinción; Los tejidos ya están listos para ser fijados y teñidos.
- Mantenga todos los cerebros disecados en un medio de cultivo celular S2 frío antes de transferirlos a la solución de PFA para cronometrar el paso de fijación.
5. Tinción cerebral en adultos
- Transfiera el cerebro aislado con una pipeta P10 a la solución de PFA a temperatura ambiente (RT). Para evitar daños en los tejidos, nunca use fórceps para transferir los cerebros después de la disección. Realice todos los pasos en tubos de PCR de 200 μL en un nutator.
- Para todos los pasos, antes de desechar la solución vieja con una pipeta P200, deje que los cerebros se asienten en el fondo del tubo. Trate de eliminar el sobrenadante sin aspirar el tejido. Proteger el tejido de la exposición a la luz.
- Fijar los cerebros en 200 μL de PFA al 2% en medio de cultivo celular S2 durante 1 h o en PFA al 4% durante 30 minutos. Mantenga los tiempos de fijación idénticos entre las muestras para aumentar la reproducibilidad.
- Después de 3 (o más) lavados de 15 minutos cada uno en 200 μL de solución de lavado de cerebro para adultos, bloquee los tejidos con 200 μL de solución bloqueante durante 30 minutos. Es posible tiempos de incubación más largos en solución de bloqueo.
- Incubar los cerebros durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en una solución de lavado de cerebro para adultos en un volumen total de 200 μL.
nota: Los tiempos de incubación pueden variar en función del tipo de anticuerpo utilizado. Pueden ser necesarias incubaciones más largas.
- Para el marcaje de los tres marcadores MCFO, incube los cerebros con anticuerpos primarios anti-HA (1:500), anti-FLAG (epítopo DYKDDDDK) (1:100) y anti-V5.
- Se podrían utilizar anticuerpos primarios conjugados directamente en lugar de la combinación normal de primarios + secundarios (p. ej., anti-V5:DyLight 549 (1:200)). En este caso, trate los anticuerpos conjugados directamente como anticuerpos secundarios.
nota: Para cada genotipo, se deben conservar algunos cerebros como controles para verificar la especificidad de la tinción. Omita la incubación primaria de anticuerpos y vaya directamente al siguiente paso.
- Lavar los tejidos 3 veces durante 1 h en 200 μL de solución de lavado de cerebro para adultos (paso 3.3) e incubarlos con conjugados secundarios de fluoróforos/anticuerpos primarios directamente conjugados diluidos en solución de lavado de cerebro para adultos durante la noche a 4 °C o durante 4 h a RT, en un volumen total de 200 μL
nota: Ejemplos de anticuerpos apropiados: AlexaFluor 488 (1:250), anticuerpos conjugados anti-V5:DyLight 549 (1:200) y DyLight 647 (1:100).
- Lavar el cerebro 3 veces durante 1 h en 200 μL de solución de lavado de cerebro para adultos, seguido de un lavado final en 200 μL de PBS durante la noche a 4 °C o durante 1-2 h en RT; el paso de lavado final en PBS elimina cualquier rastro de Triton X-100 y es necesario para obtener resultados óptimos de tinción. Monte los cerebros en un medio de montaje con un agente anti-decoloración en cubreobjetos de vidrio.
6. Montaje de cerebros para la obtención de imágenes
- Recorte un espaciador de imágenes al tamaño adecuado con unas tijeras. Para microscopía de alta resolución, coloque la muestra y el espaciador de imágenes entre dos cubreobjetos de vidrio.
nota: Los espaciadores de imagen son espaciadores adhesivos delgados (0,12 mm de grosor) que se despegan y se adhieren a cubreobjetos de vidrio o portaobjetos de microscopio, lo que permite el montaje de muestras sin compresión.
- Con unas pinzas, retire el revestimiento adhesivo de una superficie y aplique el espaciador, con el adhesivo hacia abajo, sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio (22 mm x 60 mm). Aplique 10 μL de medio de montaje a un nuevo cubreobjetos de vidrio.
- Con una pipeta P10, transfiera los cerebros del tubo de 200 μL al cubreobjetos, junto a la gota de medio de montaje. Junto con los tejidos, transfiere algo de PBS para mantener los cerebros en solución.
- Con una pipeta P10, mueva los cerebros del PBS a la gota del medio de montaje tratando de limitar la cantidad de PBS. Transfiera las muestras en el medio de montaje en el cubreobjetos con el espaciador de imágenes. Utilice suficientes medios de montaje para cubrir la muestra.
- Retire el otro revestimiento adhesivo de la parte superior del espaciador y agregue un cubreobjetos de vidrio encima de las muestras. Con la punta de una pinza, aplique una presión suave sobre el área adhesiva para sellar. Obtenga imágenes de los tejidos montados inmediatamente o guarde los portaobjetos a -20 °C para su posterior análisis.
