Transferencia mitocondrial asistida por centrifugación a células madre de glioblastoma

Resumen

Fuente: Mombo, B. N., et al. MitoCeption: transferencia de mitocondrias MSC humanas aisladas a células madre de glioblastoma. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, se demuestra un método que permite la transferencia de mitocondrias marcadas con fluorescencia a células madre de glioblastoma (GSC) a través de la centrifugación. El éxito de la captación y la integración funcional de las mitocondrias del donante se confirman mediante la detección de la fluorescencia mediante microscopía confocal.

Protocolo

Día 1

1. Marcaje de las mitocondrias de las células madre mesenquimales (MSC)

1. Dos días antes de la preparación de las mitocondrias, siembre las MSC humanas en una placa cultAure de 100 mm, en 10 ml (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (Fetal bovine serum) al 10%, para tener 4 x 10⁵ MSCs en cultivo el día 1.
2. Enjuague las MSC con PBS (4 ml) y agregue 4 ml de αMEM/FBS al 1% (precalentado a 37 °C).
3. Agregue la cantidad requerida de colorante vital mitocondrial e incube las células durante 30 minutos en la incubadora a 37 °C.
4. Retire la solución de colorante mi....

Resultados

Figura 1: Flujo de trabajo para la transferencia de mitocondrias MSC aisladas a GSC por MitoCeption. Se muestran los 7 pasos para la mitoconcepción de las mitocondrias MSC a GSCs y los análisis posteriores de GSC. Los números de paso se indican como en la sección de protocolo. Si no se realiza el marcaje MSC y GSC, al igual que para los análisis funcionales, se pueden omitir los pasos 1 y 2, y se pue.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de aislamiento de mitocondrias para tejidos	Fisher Scientific	10579663
N-2 Suplemento (100X)	Fisher Scientific	11520536
B-27 Suplemento W/O VIT A (50X)	Fisher Scientific	11500446
HBSS sin Ca2+ sin Mg2+	Sigma	H4385
Poli Hemo	Sigma	P3932
aMEM sin glutamina	Ozyme	BE12-169F
DMEM/F-12 sin glutamina,	Fisher Scientific	11540566
L-Glutamina	Invitrogen	25030-024
Glucosa	Sigma	G7021
Insulina	Sigma	I 1882
Humano bFGF	Sistemas de investigación y desarrollo	233-FB-025
EGF humano	Peprotech	AF-100-15
Heparina	Sigma	H3149
CaCl2	MERCK	2382
Inhibidor de tripsina	Sigma	T9003
DNasa I	SIGMA	10104159001
Tripsina 0.25% /EDTA 1 mM	Invitrogen	25200056
Tripsina	Gibco	15090-046
Inhibidores de la proteasa libres de EDTA	Sigma	4693159001
Ciprofloxacina	Sigma	17850-5G-F
Hongo	Invivogen	ant-fn-1
Fungizone	Termopescador	15290018
Gentamicina	Euromedex	EU0410
MitoTracker Verde FM	Sondas moleculares	M7514
MitoTracker Rojo CMXRos	Sondas moleculares	M7512
MitoTracker Rojo Profundo FM	Sondas moleculares	M22426
CellTracker Verde CMFDA	Sondas moleculares	C7025
CellTracker Azul CMF2HC	Sondas moleculares	C12881
RIPA	Santa Cruz	sc-24948
Placa de cultivo estéril FluoroDish	Instrumentos de Precisión Mundial	FD35-100
Hemacitómetro	Fisher Scientific	267110
Tubos FACS	Beckman Coulter	25,23,749
Aparato FACS	Gallios	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	Roche	3515885001