Día 1
1. Marcaje de las mitocondrias de las células madre mesenquimales (MSC)
- Dos días antes de la preparación de las mitocondrias, siembre las MSC humanas en una placa cultAure de 100 mm, en 10 ml (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (Fetal bovine serum) al 10%, para tener 4 x 105 MSCs en cultivo el día 1.
- Enjuague las MSC con PBS (4 ml) y agregue 4 ml de αMEM/FBS al 1% (precalentado a 37 °C).
- Agregue la cantidad requerida de colorante vital mitocondrial e incube las células durante 30 minutos en la incubadora a 37 °C.
- Retire la solución de colorante mitocondrial, enjuague las células dos veces con 4 ml de αMEM/FBS al 1% precalentado (37 °C) y vuelva a añadir 4 ml de αMEM/FBS al 10%. Incubar las células a 37 °C.
- Cambie el medio de cultivo (10 ml αMEM/FBS 10%) después de 30 min y, otra vez, 2 h después.
Día 1
2. Etiquetado de las células madre del glioblastoma (GSC)
- Disociar la línea celular Gb4 de GSCs (10 x 10,6 células) cultivadas como neuroesferas en matraces de cultivo celular recubiertos de poli-HEMA
- Siembre las GSC en una placa de 48 pocillos a 105 células/pocillo en medio de proliferación de GSC (500 μl) (véase el Cuadro 1).
- Centrifugar la placa a 270 x g durante 5 min a 20 °C.
- Añadir la cantidad necesaria de colorante vital celular e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Agregue 500 μl de medio basal GSC (Tabla 1) por pocillo de la placa de 48 pocillos.
- Centrifugar la placa a 270 x g a 20 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Repita los pasos 2.5 a 2.6.
- Añadir 500 μl de medio basal GSC e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Centrifugar la placa a 270 x g a 20 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Añadir 500 μl de medio de proliferación GSC por pocillo de la placa de 48 pocillos e incubar en la incubadora a 37 °C.
nota: La cantidad de GSCs indicada (10 x 10,6 células) permite realizar los diferentes experimentos dosis-respuesta y controles FACS. Una vez que las condiciones experimentales estén definidas con mayor precisión, esta cantidad puede reducirse.
3. Siembra de células madre de glioblastoma
- Recoja las neuroesferas GSC (células madre de glioblastoma) (10 x 106 células) por centrifugación a 270 x g durante 5 min, a 20 °C en un tubo de 50 ml.
- Lavar las células con 5 ml de HBSS (solución salina equilibrada de Hanks) y centrifugar a 270 x g durante 5 min a 20 °C.
- Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet de GSC en 100 μl de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) (0,25%) (por 10 x 106 células)
- Incubar a 37 °C durante 3 min.
- Añadir 10 μl de CaCl2 (20 mM) y 2 μl de DNasa I (10 mg/ml).
- Disocie las neuroesferas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (30-50x) con una pipeta P200. Evita las burbujas. Compruebe con el microscopio que todas las GSC están disociadas.
- Añadir 10 μl de inhibidor de tripsina (5%) y 10 ml de HBSS.
- Centrifugar las GSC a 270 x g durante 7 min a 20 °C.
- Deseche el sobrenadante y agregue 10 ml de medio basal GSC.
- Cuente las GSC con una cámara de recuento Thoma y, a continuación, centrifugar las células a 270 x g durante 7 min a 20 °C.
- Añadir el volumen adecuado de medio de proliferación de GSC para alcanzar la concentración celular de 106 GSCs/ml.
- Siembra 105 GSC (100 μl de la suspensión celular) por pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Centrifugar las placas a 270 x g durante 7 min a 20 °C para obtener GSC en el fondo de los pocillos.
- Incubar la placa de 96 pocillos a 37 °C.
Día 2
4. Aislamiento de mitocondrias MSC (células madre mesenquimales)
- Ajuste la temperatura de la centrífuga de microtubos a 4 °C.
- Prepare dos tubos de 1,5 ml "A" y "C" que contienen los reactivos para la extracción de mitocondrias (200 μl de reactivo A y 400 μl de reactivo C, ambos conteniendo los inhibidores de la proteasa sin EDTA). Prepare otros 2 tubos, etiquetados como "MSC" y "Mito". Mantenga todos los tubos en hielo. También prepare tubos para las diluciones seriadas de las mitocondrias.
- Lave las MSC con 10 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) precalentada (37 °C).
- Lave las MSC con 2 ml de tripsina (sin EDTA) durante 10 segundos y agregue 1 ml de tripsina (sin EDTA). Incubar las células durante 5-10 min a 37 °C.
- Recupere las MSC agregando 10 ml de αMEM /FBS 10%, transfiéralas a un tubo de 50 ml.
- Centrifugar las células a 270 x g durante 5 min a 20 °C.
- Deseche el sobrenadante y añada 10 ml de αMEM/FBS 10% al pellet de la célula.
- Cuente los MSC con una cámara de conteo Malassez.
- Centrífuga MSC (4-5 x 105) a 270 x g durante 5 min a 20 °C.
- Deseche el sobrenadante, agregue 1 m de αMEM/FBS 10% helado al pellet de la celda y transfiera las celdas al tubo marcado con "MSC". Mantenga el tubo en hielo.
- Centrifugar el tubo que contiene las MSC a 900 x g durante 5 min, a 4 °C.
- Retire todo el medio residual del tubo.
- Añadir 200 μl de reactivo de aislamiento de mitocondrias A (que contiene los inhibidores de la proteasa sin EDTA). Agite el vórtice a velocidad media durante 5 segundos y deje los tubos en hielo durante exactamente 2 minutos.
- Agregue 2,5 μl de reactivo de aislamiento de mitocondrias B. Vortex a velocidad máxima durante 10 segundos y luego deje los tubos en hielo. Repita cada 30 segundos durante 5 minutos.
- Añadir 200 μl de reactivo de aislamiento de mitocondrias C (que contiene los inhibidores de la proteasa sin EDTA). Mezcle inclinando el tubo (aproximadamente 30 veces, no haga vórtice). Centrifugar el tubo a 700 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante (que contiene las mitocondrias MSC) al tubo "Mito".
- Centrifugar a 3.000 x g, 15 min a 4 °C, para obtener el pellet de mitocondrias. Deseche el sobrenadante. El pellet contiene las mitocondrias aisladas.
- Enjuague el pellet de mitocondrias con 200 μl del reactivo C. A continuación, centrifugar a 12.000 x g, 5 min a 4 °C, para obtener el pellet de mitocondrias.
5. Transferencia de mitocondrias MSC aisladas a GSCs (MitoCeption)
- Añadir 200 μl del medio de proliferación GSC preenfriado (0 °C) al pellet de mitocondrias aislado de MSCs (4 x 105).
- Diluya la preparación de mitocondrias (en medio de proliferación de GSC) para agregar consistentemente 20 μl de suspensión mitocondrial a las GSC.
- Agregue el volumen de mitocondrias aisladas en los pocillos de la placa de 96 pocillos que contiene las GSC, a la concentración deseada (0,1 a 10 μg). Agregue las mitocondrias lentamente, cerca del fondo del pozo, cubriendo toda la superficie al menos una vez.
- Centrifugar la placa de 96 pocillos que contiene las GSC receptoras de mitocondrias con las mitocondrias MSC y la placa de control a 1.500 x g durante 15 min a 4 °C.
- Coloque las placas de cultivo en la incubadora de celdas a 37 °C inmediatamente después de la centrifugación.
nota: El protocolo de transferencia de mitocondrias se basa en la centrifugación de la suspensión de mitocondrias en las células cultivadas a la fuerza de centrifugación adecuada, con un número de centrifugaciones que se pueden ajustar según el sistema de células donantes/receptoras de mitocondrias.
Tabla 1: Medios culturales.
| Medio de cultivo celular | composición |
| GSC medio basal | DMEM/F-12 suplementado con |
| Insulina 20 mg/ml |
| Suplemento de N2 1x |
| Glucosa 3 g/L |
| L-glutamina 2 mM |
| GSC medio de proliferación | Añadir al medio basal: |
| Suplemento B27 1x |
| FEAG 10 ng/ml |
| bFGF 10 ng/ml |
| Hongo 10 mg/ml |
| Fungizone 0,25 mg/ml |
| Heparina 2 mg /ml |
| Ciprofloxacino 2 μg/ml |
| Gentamicina 2 μg/ml |
| MSC medio de proliferación | αMEM suplementado con |
| L-glutamina 2 mM |
| 10% FBS |
| bFGF 2 ng/ml |
