Tinción de fluorescencia de células de cresta neural cultivadas en hidrogeles de diversa rigidez

Resumen

Fuente: Le, T. P., et al., Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, describimos el procedimiento para realizar la tinción de fluorescencia utilizando microscopía de fluorescencia para demostrar la tinción de faloidina de células de cresta neural cultivadas en hidrogeles de diferente rigidez para visualizar y analizar la organización del citoesqueleto.

Protocolo

1. Análisis molecular de la rigidez mediante tinción de inmunofluorescencia

1. Use pinzas para transportar el cubreobjetos a una nueva placa para minimizar las señales falsas de las células cultivadas directamente en la placa. Lave las células con 500 μL de PBS estéril tres veces para eliminar las células muertas y cualquier medio de cultivo restante.
2. Fije las celdas con 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a lavar las células tres veces con 500 μL de PBS/pocillo durante 2 minutos cada una.
   NOTA: Almacenar a 4 °C para una parada de procedimiento.
3. Tratar las células con 500 μL de Triton X-100 al 0,1% durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células tres veces con 500 μL de PBS/pocillo.
4. Bloquee las células con 250 μL de suero de burro al 10% (diluido en PBS y 0,1% Tween 20) por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Incubar las células con faloidina utilizada para la tinción de F-actina a una dilución de 1:400 en 250 μL de suero de burro al 10% durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, lave las celdas tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
   NOTA: La faloidina de 568 nm puede coincubarse con anticuerpos secundarios de 488 nm o 647 nm o por sí sola.
6. Incubar las células con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, dilución 1:1000) en 250 μL de PBS durante 10 min, seguido de un último lavado de PBS durante 2 min.
7. Agregue 3-4 gotas de medio de montaje a cada pocillo. Almacene las muestras a 4 °C para que se ajusten durante al menos 2 horas antes de la obtención de imágenes para asegurarse de que el medio de montaje se haya ajustado correctamente.
8. Con un microscopio de fluorescencia, capture imágenes de al menos 3 fotogramas aleatorios por muestra de hidrogel, produciendo canales individuales y fusionados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2 mm #1 Corning 0211 Cubreobjetos de vidrio	Chemglass Ciencias de la Vida	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 Cubreobjetos de vidrio	Chemglass Ciencias de la Vida	CLS-1763-025
Placa de cultivo celular de 4 pocillos	Termo Científico	179830
4% Paraformaldehído	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% Acrilamida	Sigma Aldrich	A4058
Alexa Fluor 488 Faloidina	Thermo Fisher	A12379
Colágeno tipo I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)	Thermo Fisher	D1306
Suero de burro	Sigma Aldrich	D9663
Estéril 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Microscopio de fluorescencia	Leica