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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de las soluciones de trabajo y tampones
NOTA: En la mañana del ensayo, prepare las siguientes soluciones. Este cálculo se basa en las soluciones necesarias para procesar dos regiones del cerebro (es decir, la corteza prefrontal [PFC] y el hipocampo [HPC]) de 12 ratones.
- Prepare líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF, pH = 7.4) como se menciona en la Tabla 1. Dispense 750 μL de aCSF en cada tubo de muestreo y colóquelos en el bloque de temperatura metálico sobre hielo para preenfriar el tampón.
- Prepare el tampón de lisis como se menciona en la Tabla 2. Almacenar en hielo (400 μL a utilizar por muestra).
- Prepare una solución madre de 52 mM de bis(sulfosuccinimidil) suberado o BS3 (26x) en tampón de citrato de sodio de 5 mM (pH = 5,0).
- En primer lugar, prepare 100 mM de ácido cítrico (stock A) y 100 mM de citrato de sodio (stock B).
- Diluir el material A y el material B en una proporción de 1:20 con agua desionizada. Añadir 100 μL cada uno a 1,9 mL de agua para preparar 5 mM de ácido cítrico (caldo C) y 5 mM de citrato sódico (caldo D), respectivamente.
- Mezclar 410 μL de caldo C y 590 μL de caldo D para preparar un tampón de citrato sódico de 5 mM (pH = 5,0) (solución E, 1 mL).
- Confirme el pH de la solución E con una tira indicadora de pH.
- Disolver 24 mg de BS3 en 806,4 μL de solución E mediante vórtice durante 30 s para preparar la solución madre de BS3 (26x).
- Prepare otro 1 mL de solución E para usarlo como vehículo de control para las muestras no reticulantes.
NOTA: Prepare la solución madre BS3 cuando todo lo demás esté listo y el experimento esté a punto de comenzar. El BS3 debe almacenarse desecado a 4 °C hasta su uso. Una vez reconstituido, BS3 permanece activo solo durante aproximadamente ≤3 h. Dado que el pH del tampón de citrato de sodio de 5 mM (solución E) aumenta con el tiempo, lo que provoca una hidrólisis acelerada de BS3, se recomienda que la solución E se prepare fresca a partir de las soluciones madre A y B. Debido a la solubilidad limitada de BS3 a bajas temperaturas, el BS3 reconstituido debe mantenerse en RT. Utilice el BS3 reconstituido dentro de las 3 h, y no congele/descongele ni reutilice el BS3 reconstituido.
2. Disección de tejidos cerebrales
NOTA: A partir de este paso, al menos dos personas deben trabajar juntas de manera coordinada. Mientras una persona se enfoca en la disección del animal, la otra persona debe trabajar como cronometrador y ayudar a coordinar el ensayo.
- Lleve el primer animal para la disección del área de alojamiento a la sala de disección.
NOTA: Dado que los factores estresantes agudos (por ejemplo, un entorno nuevo, el olor a sangre) pueden afectar la dinámica de las proteínas del cerebro, los animales deben mantenerse en sus jaulas domésticas colocadas lejos del área de disección y luego ser llevados individualmente a la sala de disección para su decapitación inmediata.
- Eutanasia del ratón mediante dislocación cervical seguida de decapitación. Extraiga rápidamente el cerebro del cráneo y sumérjalo en PBS helado en una placa de Petri durante 10-15 s (Figura 1).
NOTA: Los animales no están anestesiados para los experimentos de BS3 ya que cualquier agente anestésico podría influir en el nivel de presentación de los receptores de neurotransmisores en la superficie.
- Coloque el cerebro enfriado en la matriz cerebral sobre hielo, con el lado ventral del cerebro hacia arriba (Figura 2).
- Inserte la primera hoja de afeitar a través del borde entre el bulbo olfatorio y el pedúnculo olfativo para cortar el cerebro coronalmente (Figura 3). Usando tres o cuatro hojas de afeitar adicionales, corte en serie la parte anterior del cerebro coronalmente con intervalos de 1 mm.
- Levanta los cortes coronales de la matriz cerebral sosteniendo todas las hojas de afeitar insertadas juntas, dejando la parte posterior del cerebro en la matriz cerebral. Use pinzas para separar las hojas de afeitar entre sí y colóquelas sobre la superficie plana y fría con el corte de cerebro hacia arriba (Figura 4).
- Identifique los sectores que contienen la región de interés. Para la toma de muestras del PFC, elija la segunda y tercera rebanadas posteriores a la primera rebanada que contiene el pedúnculo olfativo.
- Extirpe la región de interés con un punzón de tejido, colóquela a un lado en la hoja de afeitar fría y divida uniformemente el tejido en dos (por ejemplo, tejidos del hemisferio izquierdo frente al derecho, con una mitad que se utilizará para la reacción de reticulación BS3 y la otra mitad para el control sin reticulación si la proteína objetivo de interés se expresa por igual en ambos hemisferios).
- Pica cada pañuelo en pedazos en la hoja de afeitar usando la punta fina de las pinzas con múltiples movimientos verticales contra la hoja en lugar de machacar o moler los pañuelos. Esto maximizará el área de superficie accesible para BS3 sin comprometer gravemente la integridad de la membrana de las células. Inmediatamente después de picar, transfiera los pañuelos picados a los tubos apropiados (ver paso 3.3).
3. Reacción de reticulación
- Lleve el siguiente animal para la disección desde el área de alojamiento a la sala de disección cuando la disección del cerebro del ratón anterior esté a punto de terminar (paso 2.10).
- Añada el tubo preenfriado en hielo con 30 μL de solución BS3 (26x) o solución vehículo E justo antes de que los tejidos picados estén listos para ser transferidos a los tubos adecuados. Cambie las puntas de las pipetas entre los tubos para asegurarse de que no se contamine BS3 en los tubos de control sin reticulación.
- Transfiera los tejidos picados (del paso 2.8) a los tubos apropiados y luego comience a diseccionar el siguiente animal (paso 2.2).
- Invierta y mezcle el tubo para romper los trozos de tejido en pedazos más pequeños y comience a incubar las muestras en el rotador del tubo en la cámara fría durante 30 minutos a 2 horas. Registre la hora de inicio de la incubación BS3 para cada tubo. Consulte la sección de discusión para conocer el tiempo óptimo de incubación.
- Apague la reacción enriqueciendo el tubo con 78 μL de glicina 1 M y vuelva a incubar la muestra durante 10 minutos a 4 °C con rotación constante. Registre la hora de inicio y finalización del enfriamiento de cada tubo. Continúe ayudando a la persona que se enfoca en la disección del animal trayendo el siguiente animal (paso 3.1) y ayudando con la reticulación (paso 3.2).
NOTA: Trate cada muestra exactamente al mismo tiempo en todas las muestras. Si la sala de disección está lejos de la cámara frigorífica, se recomienda encarecidamente que se contrate a una tercera persona para que participe en la incubación y el enfriamiento de la muestra en la cámara frigorífica.
Tabla 1: La composición del líquido cefalorraquídeo artificial.
| Conc. de trabajo. | Solución de stock | Cantidad de solución madre a dispensar |
| 1,2 mM de CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM de NaCl | 5 m (34x) | 1176,5 μL |
| 2.7 mM KCl | 1,08 m (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM de glucosa | 2,5 m (250x) | 160 μL |
| Agua desionizada | | 37.563 mL |
| total | | 40 mL |
| * El caldo de CaCl2 debe estar recién preparado el día del experimento. |
Tabla 2: La composición del tampón de lisis
| Conc. de trabajo. | Solución de stock | Cantidad de solución madre a dispensar |
| 25 mM HEPES | 1 m (40x) | 500 μL |
| 500 mM de NaCl | 5 m (10x) | 2 mL |
| 2 mM de EDTA | 0,5 m (250x) | 80 μL |
| TDT de 1 mM | 1 m (1000x) | 20 μL |
| 0.1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | 100 veces | 200 μL |
| Agua desionizada | | 17 mL |
| total | | 20 mL |
