Evaluación de la absorción de glucosa en las neuronas motoras de larvas de Drosophila con metabolismo de glucosa regulado al alza

En este artículo

Resumen

Fuente: Loganathan, S., et al., Medición de la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía TDP-43. J. Vis. Exp. (2021).

El video muestra una técnica para medir la absorción de glucosa en las neuronas motoras de las larvas de Drosophila utilizando un sensor de glucosa intracelular basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET). Después de diseccionar las larvas para exponer el cordón nervioso ventral, las neuronas motoras se visualizan a través de la fluorescencia emitida por el fluoróforo donante del sensor. Cuando se estimula con glucosa, el FRET entre los fluoróforos donantes y aceptores del sensor desencadena la emisión de fluorescencia del aceptor, lo que permite comparar la absorción de glucosa entre las larvas de control y las larvas mutantes con el metabolismo de la glucosa regulado al alza.

Protocolo

1. Disecciones del cordón nervioso ventral (VNC) de Drosophila

Hacer placas de disección de elastómero de silicona.
1. Vierta los componentes del elastómero de silicona en un tubo de 50 ml como se indica en el protocolo del fabricante y revuelva bien.
2. Llene las placas de cultivo de tejidos de 35 mm con aproximadamente 2 ml de la mezcla de elastómeros. Use una jeringa para eliminar las burbujas. Cubra los platos y colóquelos sobre una superficie nivelada en un horno a 60 °C durante la noche para que se sequen.
Diseccionar las larvas de Drosophila para exponer el VNC mientras se mantiene la viabilidad del tejido.
1. Recoja una larva errante del tercer estadio, enjuague con ddH₂O y luego colóquela en una gota de tampón tipo Hemolinfa 3 (HL3) (70 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 20 mM de MgCl₂, 10 mM de NaHCO₃, 115 mM de sacarosa, 5 mM de trehalosa, 5 mM de ácido etano sulfónico de hidroxietilpiperazina [HEPES]; pH 7.1) en un plato revestido de elastómero.
2. Usando un par de pinzas (pinzas # 5 o 55) bajo un microscopio de disección, sujete con alfileres los extremos anterior y posterior de la larva con el lado dorsal hacia arriba, estirando cuidadosamente la larva a lo largo con alfileres de insectos (Minutein Pins).
3. Haz una incisión justo por encima del alfiler posterior con un par de tijeras de iris en ángulo. Haga un corte vertical desde la incisión hacia el extremo anterior de la larva.
4. Agregue unas gotas de tampón HL-3 si es necesario. Retirar la tráquea y el resto de los órganos flotantes sin alterar el sistema nervioso central (SNC). Sujete con alfileres los colgajos estirando la pared del cuerpo para exponer el SNC mientras se mantiene intacto el sistema neuromuscular (VNC, axones y uniones neuromusculares).

2. Adquisición de imágenes

Optimice los parámetros de imagen.
1. Encienda el microscopio y los láseres antes de comenzar las disecciones. Las imágenes deben adquirirse utilizando un microscopio confocal vertical con una lente de inmersión en agua de 40x. Utilice un láser de 405 nm para excitar la proteína fluorescente cian (CFP) y adquirir las imágenes en los canales de detección CFP (465-499 nm) y FRET (535-695 nm).
2. Optimice los parámetros de adquisición, como la velocidad de escaneo (6), la media (2), el objetivo (40x), el zoom (1x), el tamaño del agujero de alfiler (1 UA) y la resolución espacial (512 x 512). Ajuste la ganancia de modo que la señal esté en el rango dinámico óptimo. Se deben utilizar los mismos parámetros para todos los genotipos.
Imagen de las neuronas motoras dentro del VNC.
1. Coloque el plato de silicona con la muestra disecada debajo de la lente. Baje la lente para que entre en contacto con el tampón HL3 de trehalosa-sacarosa. Es fundamental asegurarse de que la lente esté completamente sumergida en el búfer. Agregue más búfer si es necesario.
2. Utilice los canales CFP y FRET para seleccionar manualmente una sección óptica que conste de al menos 6 neuronas motoras enfocadas, ubicadas a lo largo de la línea media VNC. Las neuronas motoras se identifican en función de la expresión del sensor de glucosa y su posición a lo largo del eje antero-posterior.
3. Adquiera imágenes cada 10 s durante 10 minutos. Estas imágenes representan la línea de base.
Estimular con glucosa suplementada HL-3.
1. Retire el tampón HL3 que contiene trehalosa-sacarosa con una pipeta Pasteur y reemplácelo con 5 mM de glucosa suplementada con HL-3 (70 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 20 mM de MgCl₂, 10 mM de NaHCO₃, 115 mM de sacarosa, 5 mM de glucosa, 5 mM de HEPES, pH 7,1). Este paso debe realizarse con mucho cuidado, para evitar el movimiento del VNC tanto como sea posible.
2. Adquiera imágenes cada 10 s durante otros 10 minutos. Estas imágenes representan la fase de estimulación.
Guarde las imágenes como archivos .czi o cualquier tipo de archivo compatible con el software de imágenes con un nombre de archivo que incluya la fecha, los antecedentes genéticos, la condición experimental (línea de base o estimulación) y los canales utilizados.
Reutilice los parámetros para obtener imágenes de todos los genotipos (Figura 1A).

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Resultados

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Figura 1: Análisis de imágenes del sensor de glucosa en el contexto del mutante TDP-43. (A) Imágenes representativas de señales FRET y CFP en controles de sensores de glucosa y muestras TDP-43^G298S en condiciones basales y de estimulación. En cada imagen se describe una neurona motora representativa como ejemplo de un retorno de la inversión. Barras de escala: 20 μm. Aumen...