$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Inmunotinción
NOTA: Realice todos los lavados e incubaciones en un agitador de plataforma orbital ajustado a aproximadamente 100 rpm. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente, excepto la incubación primaria de anticuerpos, que se realiza a 4 °C. Prepare el medio de montaje con anticipación combinando los ingredientes en un tubo de 50 ml y mezclando en un nutator durante la noche. Proteger de la luz y almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 meses. Si la señal fluorescente endógena es suficiente para la obtención de imágenes y el análisis sin necesidad de inmunotinción, se pueden omitir los pasos 1.1-1.9. Si omite la inmunotinción, realice tres lavados de 10 minutos en TBS y continúe con el paso 1.10.
- Prepare una solución fresca de TBST (0,2% de Triton en TBS) añadiendo 1 mL de Triton-X al 10% a un tubo de 50 mL y llenando el tubo hasta 50 mL con 1x TBS. Prepare 2 mL de soluciones de bloqueo y anticuerpos (10% de suero de cabra en TBST) para cada cerebro.
nota: Para obtener los mejores resultados, haga un nuevo TBST para cada nuevo experimento de tinción y utilice una fuente de alta calidad de Triton-X (tabla de materiales) acuosa al 10 %.
- Etiquete una placa de 24 pocillos de acuerdo con el esquema (Figura 1). Coloque diferentes muestras en diferentes filas y diferentes soluciones en diferentes columnas. Agregue 1 ml de TBST a las primeras tres columnas ('Lavado 1', 'Lavado 2' y 'Lavado 3'). Agregue 1 mL de solución de bloqueo a la cuarta columna.
- Prepare un pico de vidrio derritiendo el extremo de una pipeta Pasteur de 5,75 en un pequeño gancho con un mechero Bunsen. Utilice este pico para transferir secciones de tejido de la placa de 12 pocillos a la columna Wash 1 de la placa de 24 pocillos.
nota: Para obtener los mejores resultados, examina las secciones antes de comenzar a teñir. Para examinar las secciones, transfiera las secciones una por una a una placa de Petri llena de 1x TBS y examine las secciones con un microscopio fluorescente con un objetivo de 5x o 10x para asegurarse de que haya un número adecuado de células marcadas con fluorescencia. Se recomienda teñir de cuatro a seis secciones por pocillo, aunque se pueden teñir hasta ocho por pocillo si es necesario.
- Lave las secciones durante 10 minutos cada una en los pocillos Wash 1, 2 y 3, seguido de incubarlas durante 1 h en la solución de bloqueo. Use el pico de vidrio para transferir las secciones de un pozo a otro. La púa se puede utilizar para transferir varias secciones del cerebro a la vez.
- Prepare 1 mL de solución de anticuerpo primario para cada muestra (por ejemplo, Rabbit RFP 1:2000 o Chicken GFP 1:2000). Agregue el anticuerpo a la solución de anticuerpos, haga un vórtice breve y luego centrifugue durante 5 minutos a ≥ 4,000 x g a 4 °C. Incube las secciones en el anticuerpo primario durante dos o tres noches a 4 °C mientras agita.
- Después de la incubación primaria de anticuerpos, aspire el TBST del día 1 de los pocillos de lavado, agregue 1 ml de TBST nuevo a cada pocillo de lavado y mueva las secciones al primer pocillo de lavado. Lave las secciones 3 veces durante 10 minutos cada una.
nota: Para la aspiración, use una pipeta Pasteur de 9 pulgadas conectada con un tubo a un matraz de vacío. Las líneas de vacío domésticas o una bomba de vacío eléctrica se pueden utilizar como fuente de vacío.
- Mientras se lavan las secciones, prepare soluciones de anticuerpos secundarios a una concentración de 1:200 agregando anticuerpos a la solución de anticuerpos (por ejemplo, anti-conejo de cabra 594 o anti-pollo de cabra 488). Agite brevemente y luego gire durante 5 minutos a ≥ 4.000 x g a 4 °C.
- Incubar secciones en anticuerpo secundario durante 3 h a temperatura ambiente. Proteja las secciones de la luz durante este paso y todos los pasos siguientes para mitigar el blanqueo de los anticuerpos secundarios.
- Después de la incubación secundaria de anticuerpos, aspire el TBST del día 2 de los pocillos de lavado, agregue 1 ml de TBST nuevo a cada pocillo de lavado y mueva las secciones al primer pocillo de lavado. Lave las secciones 3 veces en TBST durante 10 minutos cada una.
- Durante el lavado final, saque el medio de montaje a 4 °C y deje que se caliente a temperatura ambiente. Prepare una mezcla 2:1 de 1x TBS: agua destilada y agréguela a una placa de Petri. Prepare un portaobjetos de microscopio añadiendo 800 μL de 2:1 TBS:dH2O a la superficie.
nota: Se recomienda encarecidamente el uso de medios de montaje que no se curen. El endurecimiento de los medios de montaje puede alterar el volumen del tejido, lo que puede confundir el análisis del volumen del territorio de los astrocitos. En la Tabla de Materiales se proporciona una receta para un medio de montaje casero simple y económico.
- Con un pincel fino, transfiera las secciones una a la vez desde el pozo Wash 3 a la placa de Petri. Este paso elimina el tritón y ayuda a que las secciones se aplanen. A continuación, transfiera las secciones de la placa de Petri al líquido en el portaobjetos.
- Use un pincel para ayudar a organizar las secciones de modo que queden planas en la diapositiva. Retire con cuidado el exceso de líquido del portaobjetos con una pipeta P1000, seguido de la aspiración endouterina.
nota: Añada una punta de pipeta P200 en el extremo de la pipeta Pasteur para un control más preciso de la aspiración endouterina.
- Una vez que se haya eliminado todo el exceso de líquido del portaobjetos, use una pipeta de transferencia para agregar inmediatamente una gota de medio de montaje a cada sección y coloque suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos. Deje que el medio de montaje se extienda durante unos minutos y, a continuación, retire el exceso de material de montaje que salga por debajo del cubreobjetos mediante aspiración endouterina.
nota: No permita que las secciones se sequen antes de agregar el medio de montaje. Si las secciones comienzan a secarse antes de agregar el medio de montaje, esto puede afectar el volumen del tejido e impedir la recopilación precisa de datos.
- Sella los cuatro bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Deje secar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego guárdelos en posición horizontal a 4 °C. Espere al menos 2 h antes de obtener imágenes o al día siguiente.
NOTA: Las secciones teñidas con anticuerpos contra GFP (proteína fluorescente verde) y RFP (proteína fluorescente roja) se pueden almacenar hasta 2 semanas antes de la toma de imágenes, siempre que estén completamente selladas con esmalte de uñas.
