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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.
1. Tejido de corte
- Corta un pequeño trozo de tejido (~1 cm x 1 cm) para seccionarlo. Vuelva a colocar el pañuelo restante en el congelador con hielo seco/-80 °C.
NOTA: Asegúrese de que la sección de tejido sea ~95% de la corteza cerebelosa, donde se encuentran las células de Purkinje.
- Coloque un montículo de OCT de aproximadamente 3 mm de altura para cubrir el 'mandril'. Comience construyendo las capas en la parte superior con un movimiento lento y circular hasta que haya un pequeño montículo.
- Una vez que la OCT esté parcialmente congelada pero todavía tenga algo de líquido en el centro, coloque el pañuelo encima. No empuje el tejido profundamente dentro de la OCT, deje que el tejido se asiente encima hasta que esté completamente congelado, lo que tomará de 1 a 2 minutos.
- Coloque el "mandril" con OCT congelado y el tejido en el brazo de corte del criostato. Ajuste el pañuelo para que quede al ras con la cuchilla de corte.
- Deje que el pañuelo se asiente en el brazo de corte durante 15 a 20 minutos para que se adapte a la nueva temperatura.
NOTA: Dependiendo del grosor del tejido, se necesita tiempo para la aclimatación a la temperatura. Deje que el pañuelo se asiente todo el tiempo que sea necesario para cortar limpiamente. Ajuste la OT y la TC para ayudar con la aclimatación de la temperatura de los tejidos.
- Acerque lentamente el pañuelo a la cuchilla. Una vez que el pañuelo haya llegado a la hoja, comience el proceso de recorte. El grosor del recorte debe establecerse en 30 μm.
- Recorta 2-3 veces hasta que las capas de la corteza sean visibles.
- Coloque y alinee la placa estabilizadora justo encima de la cuchilla del criostato.
NOTA: Aparecerá una línea plateada de la luz en el criostato en la interfaz de la cuchilla y la placa estabilizadora. Esto indica que la placa estabilizadora está directamente sobre el borde de la hoja.
- Comience a cortar las secciones a 14 μm. Las secciones correctamente cortadas quedarán planas debajo de la placa estabilizadora.
NOTA: Si el pañuelo está atascado, asegúrese de que la placa estabilizadora esté lo suficientemente fría. Si es necesario, colocar un trozo de hielo seco en el exterior (lado que no toque el escenario) enfriará rápidamente la placa estabilizadora.
- Corta de 4 a 6 secciones y alinéalas horizontalmente a lo largo de la etapa de criostato.
- Inclinando el portaobjetos, recoja todas las piezas del tejido a la vez.
NOTA: Usando los cepillos, levante los extremos del pañuelo para que estén más disponibles para el portaobjetos al recogerlo. No recoja una sección a la vez. La exposición al aire a temperatura ambiente degradará la integridad del ARN.
PRECAUCIÓN: No permita que la membrana toque la etapa del criostato. Si la membrana toca la plataforma, comenzará a desprenderse del portaobjetos de vidrio y causará errores al intentar LCM.
- Pase inmediatamente al paso 6. No retrase la fijación.
2. Tejido de fijación/Visualización sin manchas
- Pasar inmediatamente al protocolo de fijación de etanol
- Coloque el portaobjetos en el portaobjetos con etanol al 70% durante 2 minutos, sobre hielo.
- Coloque el portaobjetos en el portaobjetos con etanol al 95% durante 45 s, sobre hielo.
- Coloque el portaobjetos en el portaobjetos con etanol al 100% durante 2 minutos — en RT.
- Sumerja el portaobjetos 3 veces en el soporte del portaobjetos con xileno 1 — en RT.
- Coloque el portaobjetos en el portaobjetos con xileno 2 durante 5 minutos — en RT.
- Deje secar en un área limpia durante al menos 30 minutos. Los tiempos de secado más largos, de hasta 60 minutos, son óptimos.
PRECAUCIÓN: Utilice correderas de pie para secar en una campana extractora. El xileno es volátil. Colocar los portaobjetos planos hará que el xileno se acumule en la sección del tejido, lo que hará que el tejido se oscurezca demasiado.
3. Descongelar portaobjetos almacenados para su uso
- Retire el tubo con una sola corredera del congelador a -80 °C 1 h antes del uso previsto.
- No abra el tubo inmediatamente. Deje que el tubo alcance la temperatura ambiente. La condensación se producirá solo en el exterior del tubo.
- Una vez que el tubo haya alcanzado la temperatura ambiente y haya desaparecido toda la condensación (aproximadamente 30-40 min), retire la tapa y exponga el portaobjetos al aire a temperatura ambiente.
- Deje que el portaobjetos se aclimate a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Luego, déjalo dentro del tubo sin la tapa.
NOTA: La diapositiva ya está lista para LCM.
4. Microdisección por captura láser de células de Purkinje:
NOTA: Esta sección de protocolo solo discutirá detalles relacionados con la captura de células de Purkinje para la posterior secuenciación de ARN. En esta sección se supone que el usuario está familiarizado con el microscopio de captura láser UV y el software asociado.
- Limpie la platina del microscopio y el brazo de recogida de tapones con el descontaminador de RNasa.
- Con las manos enguantadas, coloque el portaobjetos en el microscopio y el tapón opaco de 500 μL en el brazo de recolección.
NOTA: Asegúrese siempre de que la técnica de ARN sea adecuada limpiando el área de trabajo con un descontaminador de RNasa y utilizando las manos enguantadas mientras toca el portaobjetos o la tapa opaca. Los guantes se pueden quitar una vez que la corredera y la tapa estén en su lugar y haya comenzado la captura láser.
- Con un aumento bajo, alinee el capuchón opaco sobre el tejido cerebeloso, asegurándose de que el capuchón cubra toda el área visualizada en el ocular.
NOTA: Solo se mostrará el ocular del microscopio si la tapa opaca está centrada. La cámara no mostrará si la tapa está centrada sobre el tejido. Dependiendo del diseño del visor de captura láser, la visualización a través de la tapa opaca se realizará solo en el ocular o se visualizará tanto en el ocular como en la cámara.
- Visualice las capas cerebelosas con una lente de objetivo de 5x a 10x y coloque el cursor sobre la sección donde se cruzan la capa molecular y la capa de células granulosas (la capa de células de Purkinje).
- Muévase a 40X y visualice las células de Purkinje.
NOTA: Véase Figura 1 y Figura 2 para ejemplos de visualizaciones.
- Comienza a capturar las células de Purkinje.
NOTA: Se requieren al menos 5 ng de ARN para realizar la secuenciación de ARN. Aproximadamente entre 1600 y 2000 células de Purkinje producen suficiente material de ARN para la secuenciación. El ARN será estable hasta 8 horas en el microscopio. Pruebe la energía UV y el enfoque UV antes de la recolección para asegurarse de que los niveles sean correctos. Con el tiempo, el tejido continuará secándose y es posible que sea necesario cambiar la energía UV y el enfoque UV.
