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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Almacenamiento de cerebros
- Extraiga rápidamente los cerebros de ratones adultos CD1 de tipo salvaje sacrificados que pesen aproximadamente 30 g utilizando un enfoque convencional y congele rápidamente durante 60 segundos en nitrógeno líquido o isopentano preenfriado con hielo seco.
- Guarde los cerebros congelados a -80 °C en papel de aluminio o tubos cónicos hasta su uso.
2. Preparando la matriz cerebral
- Veinticuatro horas antes de diseccionar el tejido, coloque una matriz cerebral limpia en una pila de paquetes de congelador descongelados. Intercala los lados de la matriz entre dos paquetes de congelación, asegurándote de dejar aproximadamente 0,5 cm entre la parte inferior de las ranuras de la maquinilla de afeitar y la parte superior de los paquetes de gel (Figura 1A). Coloque papel de aluminio en los extremos para ayudar a enfriar.
NOTA: Cuando compre una matriz cerebral, compre una que sea lo suficientemente grande como para encapsular todo el volumen del cerebro que se va a diseccionar.
- Coloque la caja que contiene la matriz cerebral y los paquetes de congelación en un congelador a -20 °C con la parte superior entreabierta durante la noche.
3. Configurar una placa de vidrio congelada
NOTA: El propósito de esta configuración es preparar una superficie congelada en la que diseccionar secciones del cerebro.
- Coloque el hielo en una caja aislada a una distancia aproximada de 5 cm de la parte superior. A continuación, coloque una capa de hielo seco de 2,5 cm sobre el hielo y cúbrala con una lámina de plástico negro para ayudar a visualizar la muestra (Figura 1B, Figura 1C).
- Coloque una placa de vidrio (debe caber en la abertura de la caja) encima del plástico y coloque hielo seco encima de la placa en las esquinas más alejadas (Figura 1C).
- Saca la matriz de cerebro congelada del congelador e inserta el cerebro para cortarlo con la corteza hacia arriba. Deje que se equilibre a la temperatura de la caja durante 10 minutos. Mantenga la tapa de la caja durante este tiempo.
- Ajuste la posición del cerebro en la matriz con pinzas frías para que el seno sagital y el seno transverso se alineen con los surcos perpendiculares del bloque (Figura 1D). Esto ayudará a asegurar secciones simétricas para facilitar la disección. Toque las puntas de las pinzas con el hielo seco brevemente para que se enfríe antes de ajustar el cerebro.
- Una vez que el cerebro esté en posición, coloque una hoja de afeitar fría cerca de su centro y presione la hoja aproximadamente 1 mm en el tejido. Agregue cuchillas frías en los extremos rostral y caudal para ayudar a mantener el cerebro en su lugar (Figura 2A y Figura 2B).
- Comenzando en el extremo rostral, agregue las cuchillas una a la vez, colocándolas en las ranuras y presionándolas suavemente hacia abajo en el tejido aproximadamente 1 mm (Figura 2B). Continúe agregando cuchillas a intervalos de 1 mm trabajando hacia el extremo caudal.
- Asegúrese de que el cerebro no cambie durante este tiempo. Alinee las cuchillas horizontal y verticalmente (Figura 2B). Las cuchillas de micrótomo de bajo perfil se pueden utilizar para cortar secciones en anchos de 0,5 mm. Colócalos entre las hojas de afeitar más grandes (Figura 2C).
- Una vez que las cuchillas estén en su lugar, presione hacia abajo la parte superior del grupo con los dedos, la palma de la mano o alguna otra superficie plana (Figura 2C, Figura 2D). Balancee el grupo de cuchillas lentamente de lado a lado para moverlas a través del tejido.
nota: Esto puede llevar algún tiempo (1–2 min) y requiere paciencia. Debe haber resistencia a las cuchillas que se mueven a través del tejido. La entrada fácil significa que el cerebro se está descongelando y el bloque debe enfriarse con hielo seco.
- Cuando todas las cuchillas hayan llegado al fondo de las ranuras, agarre cada lado del grupo de cuchillas y muévase hacia adelante y hacia atrás para trabajar libre de la matriz><.
nota: Tenga cuidado de evitar cortarse con los bordes afilados de las cuchillas.
- Una vez que el grupo esté libre, coloque la pila, con el lado rostral hacia arriba, sobre la placa de vidrio (Figura 2E). Coloque hielo seco al lado y/o encima de la pila para congelar aún más las muestras y facilitar la separación.
- Coloque la pila con bordes afilados hacia abajo sobre la placa de vidrio y separe las cuchillas desplazando la pila entre los pulgares y los dedos. Las cuchillas deben estar separadas entre sí con secciones unidas.
- Alinee las secciones en la placa de vidrio desde la rostral hasta la caudal (Figura 2F).
- Separe el tejido de las cuchillas flexionando las hojas entre los dedos o separándolas con una segunda navaja de afeitar fría (Figuras 2G, 2H, 2I).
4. Disección de secciones
- Abra el Atlas del Cerebro del Ratón Allen u otra referencia y encuentre los puntos de referencia necesarios para identificar las regiones de interés. Algunos puntos de referencia obvios incluyen la comisura anterior, el cuerpo calloso, los ventrículos laterales y el hipocampo (Figura 3).
- Voltee la sección que se va a cortar con pinzas frías y asegúrese de que la región que se va a recoger sea consistente en todo momento. Durante la cosecha, consulte el atlas de referencia a menudo para asegurarse de que se obtiene el ROI correcto.
NOTA: Una lupa o un microscopio de disección suelen ser útiles en este proceso. Una buena iluminación también es fundamental. Para ello se pueden utilizar lámparas LED de baja potencia o una lámpara fría.
- Con un bisturí o punzón limpio, corte la sección (Figura 4). Enfríe previamente cada herramienta antes de cortarla tocándola brevemente con hielo seco. Empuje la cuchilla suave pero firmemente en el pañuelo, balanceándola hacia adelante y hacia atrás para hacer el corte. No empuje demasiado fuerte o el tejido se fracturará.
NOTA: Las herramientas se calentarán con el tiempo. Las cuchillas ligeramente calentadas pueden ayudar a hacer cortes limpios y limitar la fractura, pero tenga cuidado de evitar descongelar el tejido. Enfríe periódicamente las herramientas sobre hielo seco.
- Una vez que se haya cosechado un retorno de la inversión, colóquelo en tubos de 1,5 ml preenfriados y etiquetados. Almacene los pañuelos cosechados a -80 °C hasta que los necesite.
