Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Cultivo y carga de disco intervertebral (IVD)
- Transfiera los discos intervertebrales (IVD) a las cámaras de IVD y agregue medio de cultivo IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L de DMEM de alta glucosa para el grupo fisiológico y 2 g/L de DMEM de baja glucosa para el grupo patológico) + 1% de penicilina/estreptomicina + 2% de suero fetal de ternero + 1% de ITS (contiene 5 μg/mL de insulina, 6 μg/mL de transferrina y 5 ng/mL de ácido selinio) + 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato + 1% de aminoácidos no esenciales + 50 μg/mL de agente antimicrobiano para células primarias) y colocar en una incubadora a 37 °C, 85% de humedad y 5% de CO2.
- Cultivar los discos durante 4 días dentro de un sistema de biorreactor según grupos experimentales. En el grupo patológico, mantener las condiciones de carga degenerativa a 0,32-0,5 MPa, 5 Hz durante 2 h/día. En el grupo de control fisiológico, utilizar un protocolo de carga de 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz durante 2 h/día.
NOTA: Coloque los IVD en cámaras que contengan 5 mL de medio IVD durante los procedimientos de carga. El volumen depende del tamaño de las cámaras de carga del biorreactor. Entre los procedimientos de carga, coloque los IVD en placas de seis pocillos con 7 mL de medio de cultivo IVD para la recuperación de la hinchazón libre.
- Para analizar los cambios en la altura del disco durante el período experimental, mida la altura del disco con un calibrador después de la disección IVD (línea de base) y luego diariamente después del período de hinchamiento libre y después de la carga dinámica durante la duración experimental.
2. Inyección del factor de necrosis tumoral intradiscal alfa (TNF-α)
- Inmediatamente después del primer ciclo de carga dinámica el día 1, coloque los IVD en una placa de Petri en posición vertical y estabilice los IVD con una pinza.
- Inyecte TNF-α recombinante (100 ng en 70 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por IVD) con una aguja de insulina de calibre 30 en el tejido pulposo del núcleo del grupo patológico. Inyecte lentamente a una velocidad de aproximadamente 70 μL en 1 min.
- Después de la inyección, tire de la jeringa hasta la mitad dentro del IVD y tire del émbolo de la jeringa para crear un vacío que evite que la solución inyectada se escape hacia atrás antes de retirar la aguja y la jeringa por completo del IVD.
NOTA: Realice un experimento piloto inyectando PBS que contenga colorante azul de tripano para evaluar la distribución de la solución inyectada después de la carga y el cultivo durante la noche.
