Inducción de una lesión cerebral traumática en un modelo de rata utilizando un dispositivo de percusión de fluido lateral

Resumen

Fuente: McGuire, M. J., et al. Uso de un sistema inalámbrico de video-EEG para monitorizar las descargas epileptiformes tras una lesión cerebral traumática inducida por la percusión lateral del fluido. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra la inducción de una lesión cerebral traumática (TBI) en una rata utilizando un dispositivo de lesión por percusión de fluido lateral (FPI). El procedimiento consiste en crear un agujero en el cráneo de una rata anestesiada para exponer la duramadre, a la que se conecta una cánula. Luego, la rata se conecta al dispositivo, que genera una onda de presión que llega al cerebro, imitando el traumatismo craneoencefálico al causar la muerte de las células neuronales y el daño vascular

Protocolo

1. Lesión por percusión fluida

1. Use una bata de laboratorio o bata quirúrgica, mascarilla quirúrgica, guantes quirúrgicos y cubierta para la cabeza y esterilice todas las herramientas y materiales que entren en contacto con el sitio quirúrgico.
2. Anestesiar una rata Wistar macho de 10-12 semanas de edad (350-400 g) con isoflurano al 3% y 1 L/min de oxígeno en una cámara de inducción de tamaño adecuado para ratas. Retira a la rata de la cámara de inducción y muévela al área de preparación una vez que esté inconsciente. Coloque el ungüento oftálmico estéril en ambos ojos.
3. Afeita el pelo de la cabeza de la rata con una maquinilla eléctrica con una cuchilla #40 desde justo por encima de los ojos hasta la base caudal de las orejas para producir suficiente campo quirúrgico. Retira el pelo suelto y recortado del sitio.
4. Limpie el sitio quirúrgico aplicando un exfoliante de clorohexidina al 2% en el cuero cabelludo afeitado seguido de etanol al 70%. Comience en el centro y muévase hacia afuera en círculos concéntricos alejándose del sitio de la incisión. Repite este proceso 3 veces. Aplique la solución de Betadine en el sitio de la misma manera y deje secar.
5. Coloque la rata anestesiada en el marco estereotáxico y mantenga la anestesia al 2-3% de isoflurano-1 L/min de oxígeno a través del cono nasal. Verifique la pérdida del reflejo de retirada de la extremidad posterior y la pérdida del reflejo palpebral para asegurarse de que la rata esté en un plano quirúrgico de anestesia.
6. Controle la frecuencia respiratoria, la frecuencia cardíaca, la temperatura corporal y la saturación de oxígeno durante toda la cirugía. Mantener la frecuencia cardíaca entre 300-400 lpm y la SpO₂ por encima del 90%.
   nota: Se puede utilizar un oxímetro de pulso conectado a un pie trasero para proporcionar una lectura constante de la frecuencia cardíaca y la SpO₂. Una frecuencia cardíaca superior a 400 lpm indica que la rata no está suficientemente anestesiada. Una almohadilla térmica autorregulable, acoplada a un termómetro rectal, ajustado a 37 °C, se puede colocar debajo de la rata durante toda la cirugía para mantener la temperatura corporal. Un microscopio estereoscópico con una fuente de luz en combinación con una lámpara de fibra óptica es útil para visualizar el procedimiento.
7. Utilice una aguja de 23 g para inyectar clorhidrato de bupivacaína al 0,5% por vía intradérmica en el cuero cabelludo en el sitio de la incisión para la analgesia local 10 a 15 minutos antes de hacer una incisión.
8. Haz una incisión de 1,5-2,5 cm en la línea media a través de la piel y el músculo del cuero cabelludo con una hoja de bisturí #10. Retraiga la piel y el músculo para exponer el cráneo y proporcionar un campo quirúrgico despejado. Refleje la fascia subyacente y el tejido graso lejos del hueso con hisopos de algodón estériles.
   nota: Una unidad de cauterización eléctrica es útil para lograr una hemostasia rápida.
9. Afeitar la cresta lateral del hueso parietal izquierdo con una cureta quirúrgica para producir una superficie lisa y plana de modo que la base del cubo de Luer hembra-hembra pueda quedar al ras del cráneo.
10. Irrigar la superficie del cráneo y los tejidos circundantes con 2,0 mg/ml de solución de gentamicina en solución salina estéril. Seque el exceso de solución con un hisopo estéril.
11. Aplique peróxido de hidrógeno al 3% en el cráneo para secar el hueso.
    nota: Si el hueso no está lo suficientemente seco, el cemento dental no se adherirá correctamente y formará un sello sólido.
12. Cree un sitio de craniectomía de 5 mm de diámetro a través del hueso parietal izquierdo.
    nota: Una broca de trépano colocada en un taladro eléctrico conectado al marco estereotáctico puede ser útil para iniciar la craneectomía. Use un taladro manual con una trépano de 5 mm de diámetro para terminar lentamente la craniectomía a través del hueso restante. Cuando esté cerca de completar la craniectomía, gire la trépano en reversa para evitar la ruptura de la duramadre subyacente. Habrá un adelgazamiento del cráneo alrededor del perímetro del disco y el colgajo del cráneo se sentirá suelto cuando se presione ligeramente.
13. Retire el colgajo óseo con la cureta quirúrgica y las pinzas de tejido liso.
    nota: Puede ocurrir algo de sangrado, pero la hemostasia se puede lograr rápidamente aplicando una presión suave con hisopos de algodón estériles.
14. Use un microscopio estereoscópico e iluminación para inspeccionar visualmente la duramadre en busca de signos de ruptura. Quedará un borde delgado de hueso alrededor de la circunferencia del sitio de la craniectomía. Retire suavemente este borde con pinzas de tejido liso, teniendo cuidado de no romper la duramadre.
15. Frote el cráneo con etanol al 70% para eliminar el polvo de los huesos y secar el cráneo.
16. Aplique una capa delgada de pegamento en gel de cianoacrilato alrededor del borde inferior del cubo Luer lock y asegúrelo al cráneo sobre la craniectomía sin obstruir la abertura. Tenga cuidado de no poner el pegamento en contacto con la duramadre. Además, selle la cerradura Luer en su lugar con una capa delgada adicional de pegamento alrededor de la base exterior del cubo.
17. Prepara una lechada de cemento dental. Aplique el cemento a la superficie del cráneo alrededor y sobre la base del cubo de la cerradura Luer para asegurarlo en su lugar.
18. Llene el cubo Luer lock con una solución estéril de líquido cefalorraquídeo artificial (LCR) sin conservantes (pH 7.4) usando una jeringa y una aguja para que se pueda ver un bolo convexo de solución salina por encima de la parte superior del borde><. nota: La solución mantendrá la duramadre húmeda a medida que el cemento dental se seca, así como sirve como una indicación de la integridad del sello. Si el nivel de la solución cae, es una indicación de una fuga en el sistema y el bloqueo Luer debe retirarse y reemplazarse.
19. Una vez que el cemento dental esté completamente curado, suspenda la anestesia con gas y retire la rata del marco estereotáxico.
20. Coloque la rata en una plataforma junto al dispositivo FPI.
21. El dispositivo FPI tiene una punta metálica curvada que se extiende desde el transductor de presión en el extremo del depósito de fluido. Asegure un tubo de presión de 12 cm de longitud al extremo de la punta curvada con el extremo opuesto que termine en un conector giratorio Luer lock macho de 2 cm. Asegure la rata al dispositivo FPI conectando el extremo hembra del cubo en el cráneo de la rata al conector macho.
    nota: Asegúrese de que la conexión esté bien asegurada y de que se hayan eliminado todas las burbujas de aire del sistema.
22. Coloque al animal en decúbito esternal y verifique repetidamente el retorno del reflejo de retirada. Tan pronto como la rata recupere el reflejo de retirada pero aún esté sedada, suelte el péndulo del dispositivo FPI para causar un solo pulso de presión de 20 ms e inducir lesiones><. nota: Es importante no inducir la lesión mientras el animal está profundamente anestesiado, ya que esto tiende a causar un aumento de la mortalidad debido al edema pulmonar inducido por neurógenos. Todos los dispositivos muestran variabilidad. Sin embargo, en el dispositivo utilizado para este experimento, una colocación del martillo en un ángulo de 17° produce un pulso de presión atmosférica de 2,2 a 2,3. Los animales simulados no heridos se someten a los mismos procedimientos, con la excepción del pulso de fluido real para inducir la lesión.
23. Desconecte inmediatamente a la rata del dispositivo FPI después de una lesión, colóquela en decúbito esternal y proporcione oxígeno suplementario (1 L/min) a través de un cono nasal hasta que vuelva la respiración espontánea. La apnea es una consecuencia anticipada de la lesión. Si es necesario, proporcione respiraciones manuales periódicas a través de una máscara con válvula de bolsa hasta que la rata comience a respirar espontáneamente por sí sola.
    nota: Por lo general, la apnea dura menos de 2 minutos. Se observa un aumento rápido y transitorio de la frecuencia cardíaca (>500 lpm) inmediatamente después de la administración del pulso de presión debido a un estallido de catecolamina. Esto se puede controlar con un oxímetro de pulso conectado a la pata de la rata y puede servir como un posible indicador de que se ha producido una lesión grave.
24. Monitoree a la rata continuamente y registre el tiempo de retorno del reflejo de enderezamiento (deambulación estable en las cuatro extremidades).
25. La magnitud del pulso de presión atmosférica para cada rata debe estar dentro de ± 0,05 atmósferas entre sí. Confirme que cada uno de los pulsos de presión produce una señal suave en el osciloscopio con amplitud y duración constantes.
    nota: Una señal ruidosa puede indicar burbujas de aire en el sistema que deben eliminarse antes de emitir el pulso de lesión. Los pulsos de presión atmosférica que producen una lesión grave, en este experimento, son los que suelen dar lugar a tiempos de enderezamiento de los animales de 30 a 60 min. Este rango de tiempos de adrizamiento se asocia con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 40-50%).
26. Administre 10 ml de solución salina precalentada por vía subcutánea como tratamiento de apoyo.
27. Regrese la rata a su jaula de origen y permita que se recupere durante al menos 4 h.
    nota: Se ha observado un aumento de la mortalidad cuando las ratas se vuelven a colocar inmediatamente bajo anestesia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Brocas de 1,00 mm	Drill bit City: Nuevas herramientas de carburo	05M200
Cemento de carboxilato 3M ESPE Durelon	3M , Neuss Alemania	38019	Cemento dental
4-0 Sutura	Ethicon, Sommerville, Nueva Jersey	K831H	4-0 Ethicon Seda Permanente a Mano, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Negro Trenzado Sutura no absorbible
Trépano de 5 mm de diámetro exterior	Herramientas de Bellas Ciencias	18004-50
Pinzas Dumont #6	Herramientas de Bellas Ciencias	11260-20
Pinzas de #7b Dumont	Herramientas de Bellas Ciencias	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Acoplador de estilo de rosca Luer hembra de policarbonado transparente	Instrumento Cole-Palmer	SKO#45501-22	Lote de pedido #214271
Taladro eléctrico de pie	Grobet Estados Unidos, Carlstadt, NJ	Modelo C-300
GentaMax 100 (gentamicina, solución de sulfato)	Phoenix, fabricado por Clipper Distributing Company LLC, St. José, MO		NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canino/ Felino	Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
Software IOX2	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorano, USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, India		NDC 66794-013-25
Máquina de anestesia IsoTech	SurgiVet	WWV9000
Dispositivo FPI lateral	AmScien	Artículo 302	punta curvada, con extensión de tubo de presión. conectada a través de un conector de bloqueo de tornillo (Cole-Palmer; #4550-22)
Microscopio estereoscópico Leica A60	Leica Biosystems, Richmond, VA	PN: 10 450 488
Marcaína (0,5%) Bupivacaína hcl inyección usp 5 mg/mL	Hospira, Bosque del Lago, IL	CA-3627	Frasco de dosis múltiple de 50 ml; NDC 0409-1610-50
Pinzas Micro-Adson	Herramientas de Bellas Ciencias	11018-12
Portaagujas Olsen-Hegar con cortadores de sutura	Herramientas de Bellas Ciencias	12002-14
PALACOS R+G cemento óseo con gentamicina	Heraeus,	REF: 5036964	Cemento óseo radiopaco que contiene 1 x 0,5 g de gentamicina
Solución de povidona yodada			Betadine
Ungüento Veterinario Puralube	Productos veterinarios Dechra, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
Hoja de bisturí (#10) y soporte	Integra Miltex, York, PA	REF: 4-110
Mango de bisturí - #4	Herramientas de Bellas Ciencias	10004-13
Cuchillo de hoz	Bausch + Lomb Storz Instrumentos	N1705 HM	Hoja curva de 5mm. Mango redondo. Longitud total 168 mm, 6,6 pulgadas.
Micro espejo Silverstein	Bausch + Lomb Storz Instrumentos	N1706 S8	3mm de diámetro. Ángulo de 45 grados. Longitud total 180 mm, 7,2 pulgadas
Unidad de cauterización térmica	Tecnología Médica Geiger, Delasco Council Bluffs, IA	N.º de modelo: 150
Vetivex	Productos veterinarios Dechra, Overland Park KS		Inyección veterinaria pHyLyteTM pH 7.4 (Inyección de Electrolitos Múltiples, Tipo 1, USP)
Ratas Wistar IGS	Río Charles	Código de cepa 003	12 semanas de edad en el momento de la lesión
Retractor Wullstein	Herramientas de Bellas Ciencias	17018-11