Obtención de una suspensión unicelular a partir de tejido cerebral de rata congelado

Resumen

Fuente: Rubio, F. J., et. Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y análisis de expresión génica de neuronas que expresan Fos a partir de tejido cerebral de rata fresco y congelado. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra la disociación de tejido cerebral de rata congelado en una suspensión de una sola célula utilizando digestión enzimática y trituración mecánica. Las células preparadas se fijan y permeabilizan con etanol para aplicaciones posteriores como la citometría de flujo o el análisis de expresión génica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación antes de la recolección de tejidos

1. Ajuste la centrífuga a 4 ^oC.
2. Pule al fuego un juego de tres pipetas Pasteur de vidrio con diámetros decrecientes de aproximadamente 1,3, 0,8 y 0,4 mm para cada muestra.
3. Prepare tubos etiquetados de 1,7 ml que contengan 1 ml de tampón A frío y mantenga los tubos en hielo.
4. Prepare una bandeja de hielo que contenga la matriz de corte de cerebros, espátulas y pl....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz cerebral	CellPoint Scientific	69-2160-1	Para obtener cortes de cerebro coronal
Hibernar Una baja fluorescencia	Pedazos de cerebro	HA-lf	El tampón A' en el protocolo se utiliza para procesar tejidos y células desde las etapas de disociación hasta las de fijación
Accutase	Millipore	SCR005	La solución enzimática' en el protocolo se utiliza para la digestión enzimática del tejido antes de la trituración
Colador de células, 40 μm	Halcón BD	352340	Para filtrar la suspensión de células
Filtro de células, 100 μm	BD Halcón	352360	Para filtrar la suspensión de células
Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo Falcon de 5 ml con tapón a presión de filtro de celdas	BD Biociencia	352235	Para filtrar la suspensión celular antes de pasar a través del citómetro de flujo
Pasteur Pipeto, Vidrio	Suministro de los NIH	6640-00-782-6008	Para hacer trituración de tejidos