Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación antes de la recolección de tejidos
- Ajuste la centrífuga a 4 oC.
- Pule al fuego un juego de tres pipetas Pasteur de vidrio con diámetros decrecientes de aproximadamente 1,3, 0,8 y 0,4 mm para cada muestra.
- Prepare tubos etiquetados de 1,7 ml que contengan 1 ml de tampón A frío y mantenga los tubos en hielo.
- Prepare una bandeja de hielo que contenga la matriz de corte de cerebros, espátulas y placas de vidrio (o placa de Petri de vidrio invertido) en la que realizar la disección. Enfríe previamente dos o más hojas de afeitar en las placas de vidrio y use papel de seda para secar todos los instrumentos que toquen el pañuelo.
- Descongele la solución enzimática a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos antes de la recolección de tejidos.
2. Recolección y disección de tejidos
- Iniciar el tratamiento conductual o farmacológico 90 min antes de la recolección de tejidos.
nota: Para los resultados que se muestran aquí, se realizaron inyecciones intraperitoneales agudas de 5 mg/kg de metanfetamina en ratas en un entorno nuevo (condición de prueba) y ratas naïve mantenidas en sus jaulas domésticas (condición de control).
- Anestesiar a la rata colocándola en un frasco desecador de vidrio con isoflurano saturado y decapitar a la rata 30 a 60 segundos después usando una guillotina><.
Use tijeras para quitar la piel y el músculo de la cabeza y exponer el cráneo. Usa rongeurs para cortar el cráneo, abrir el foramen magnum y quitar la parte posterior del cráneo. Use rongeurs para cortar a lo largo de los bordes superiores del cráneo para exponer el cerebro. Tenga cuidado de no dañar el cerebro. Use una espátula pequeña para colocar suavemente debajo y elevar el cerebro. Eleva el cerebro y corta los nervios hasta que el cerebro quede libre.
- Disecciona el tejido con cuchillas de afeitar.
nota: Obtener muestras de tejido utilizando cualquiera de los siguientes métodos: (2.3.1) tejido recién disecado; (2.3.2) tejido congelado después de la disección; o (2.3.3) tejido congelado diseccionado de cerebro entero congelado. Mantenga la matriz de corte de cerebro, las hojas de afeitar y la placa de vidrio secas durante los procesos de disección y picado, ya que el agua condensada puede provocar una lisis hipotónica de las células. Use lupas para asegurar una disección precisa.
- Para el tejido recién diseccionado, coloque el cerebro recién extraído en una matriz de corte de cerebro (un molde de metal con forma de cerebro de rata con ranuras para las hojas de afeitar a intervalos de 1 mm) que se haya enfriado en hielo. Inserte dos o más hojas de afeitar preenfriadas en las ranuras para cortar cortes coronales que contengan la(s) región(es) cerebral(es) de interés. Coloque la rebanada cortada en el plato de vidrio frío.
Nota: Diseccione las regiones cerebrales de interés en una placa de vidrio enfriada.
- Para el tejido congelado después de la disección, diseccione la(s) región(es) cerebral(es) de interés a partir de cortes de cerebro recién extraído, similar a lo descrito anteriormente en 2.3.1. Coloque el tejido disecado en un microtubo y congele rápidamente el tejido sumergiendo el microtubo en isopentano a -40 ºC durante 20 segundos. Mantenga el tejido diseccionado congelado en todo momento en un congelador a -80 ºC hasta su posterior procesamiento.
- En el caso de los tejidos congelados, congele inmediatamente el cerebro recién extraído en isopentano a -40 ºC y guárdelo en una bolsa sellada a -80 ºC durante un máximo de 6 meses.
- El día de la disección, coloque el cerebro congelado en un criostato colocado a aproximadamente -20 ºC (no más de -18 ºC) durante aproximadamente 2 horas para equilibrar la temperatura><.
nota: Los cerebros se pueden cortar fácilmente a esta temperatura, mientras que las temperaturas mucho más frías hacen que el cerebro sea demasiado frágil para cortarlo de manera segura.
- Use hojas de afeitar para cortar cortes coronales de 1 a 2 mm de los cerebros congelados en un criostato. En condiciones de congelación, use una aguja desafilada de calibre 12 a 16 para obtener punzones de tejido de estas rebanadas. Mantenga el tejido diseccionado congelado en todo momento hasta su posterior procesamiento.
- Agregue 1 a 2 gotas de tampón A para cubrir el tejido diseccionado antes de picar. Retire la mayor parte de la materia blanca del tejido con dos hojas de afeitar para evitar la pérdida de neuronas durante el resto del proceso de trituración. Si comienza con pañuelo congelado, deje que el pañuelo se descongele en la placa de vidrio fría durante no más de 1 minuto antes de aplicar la solución tampón A.
- Picar el tejido 100 veces en cada dirección ortogonal con una cuchilla de afeitar en una placa de vidrio fría. Sostenga la hoja de afeitar verticalmente contra la placa de vidrio al picar.
nota: El picado minucioso es fundamental para todos los pasos del protocolo.
- Utilice hojas de afeitar para transferir el tejido picado a tubos de microcentrífuga que contengan 1 ml de tampón A frío. Invierta el tubo de 3 a 5 veces para mantener todo el tejido picado en la solución.
3. Disociación celular
NOTA: Utilice una mezcla suave de extremo a extremo para todos los siguientes pasos. No utilice un mezclador de vórtice y evite las burbujas de aire que causan daño a las células.
- Centrifugar los tubos de muestra a 110 x g durante 2 min a 4 ºC. Deseche el sobrenadante. Agregue lentamente 1 ml de solución enzimática fría y recién descongelada (que contenga una mezcla de enzimas proteolíticas) por la pared interna del microtubo. Aspire inmediatamente todo el pellet y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo solo 4 veces con una pipeta de diámetro de punta moderadamente grande para dispersar el pellet de tejido picado.
- Invierta los microtubos inmediatamente para evitar que el pellet se pegue al fondo e incube las muestras mezclando de extremo a extremo durante 30 min a 4 oC.
- Después de la digestión enzimática del tejido, centrifugar los tubos a 960 x g durante 2 min a 4 ºC. Retirar el sobrenadante y añadir 0,6 ml de tampón A frío. Inmediatamente después de añadir el tampón A, utilizar la misma punta de pipeta para dispersar el pellet aspirando todo el pellet y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
- Triturar mecánicamente el tejido digerido y recogerlo en tubos de 15 ml siguiendo los siguientes pasos. Para cada muestra, utilice un juego separado de 3 pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego con diámetros descendentes de aproximadamente 1,3, 0,8 y 0,4 mm unidas a bombillas de látex.
- Triture suavemente cada muestra 10 veces con la pipeta de vidrio de 1,3 mm. Deje que la muestra se asiente durante 2 minutos en hielo (los restos y las células no disociadas se asentarán en el fondo). Recoja el sobrenadante (~ 0,6 ml) y transfiéralo a un tubo cónico de 15 ml (tubo # 1).
- Añada 0,6 ml de solución tampón A al pellet restante. Triture la muestra 10 veces con la pipeta de vidrio de 0,8 mm. Deje reposar la muestra durante 2 minutos en hielo. Recoja el sobrenadante (~ 0,6 ml) y transfiéralo al mismo tubo cónico de 15 ml # 1.
- Añada 0,6 ml de solución tampón A al pellet restante. Triture la muestra 10 veces con la pipeta de vidrio de 0,4 mm. Deje reposar la muestra durante 2 minutos en hielo. Recoja el sobrenadante (~ 0,6 ml; sin tocar el pellet con células no disociadas) y transfiéralo al mismo tubo cónico de 15 ml # 1.
nota: Mantenga la pipeta de 0,4 mm de diámetro en el tubo #1 durante los siguientes pasos de trituración.
- Repita el paso 3.4.3 tres veces más con la pipeta de vidrio más pequeña (~ 0,4 mm de diámetro) y recoja el sobrenadante en un tubo cónico separado de 15 ml (tubo #2).
- Triture las suspensiones celulares recolectadas en los tubos #1 y #2 durante 10 veces más con la pipeta de vidrio de 0,4 mm y manténgalas en hielo.
4. Fijación y permeabilización celular
- Prepare 4 microtubos por muestra (dos microtubos para las células del tubo #1 y dos para las células del tubo #2) añadiendo 800 μl de etanol 100% frío (almacenado a -20 oC antes de su uso) en cada tubo y manténgalos en hielo. Nota: La concentración final de etanol será del 50%.
- Pipetear ~ 800 μl de las suspensiones celulares (del tubo # 1 y el tubo # 2) en cada uno de los 4 tubos que contienen etanol frío e invertir los tubos para mezclar las muestras.
- Incube los tubos en hielo durante 15 minutos mientras invierte los tubos cada 5 minutos.
- Después de la fijación/permeabilización, centrifugar los tubos a 1.700 x g durante 4 min a 4 ºC y desechar el sobrenadante. Dejar 50 μl de solución para evitar la pérdida de células.
nota: Los gránulos en esta etapa son blancos y se adhieren menos a la pared de los tubos que antes de la permeabilización. Por lo tanto, retire el sobrenadante con cuidado tocando la pared del microtubo donde no haya gránulos y extraiga el sobrenadante lentamente con una micropipeta.
5. Filtración celular
- Vuelva a suspender los pellets del paso 4.4 con PBS frío de la siguiente manera:
- Añada 550 μl de PBS frío a uno de los dos microtubos procedentes del tubo #1, y utilice una punta de pipeta de diámetro moderadamente grande para pipetear suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Repita lo mismo para un microtubo que viene del tubo # 2.
- Para las células del tubo #1, utilizando la misma pipeta, transfiera la primera suspensión de células al segundo pellet. Vuelva a suspender el segundo pellet pipeteando suavemente la suspensión de celda combinada hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
- Para las células del tubo #2, vuelva a suspender y combine los gránulos (es decir, el tercer y cuarto microtubos) como se describe en 5.1.2.
